玉米光周期敏感基因ZmELF4的克隆及功能验证

论文摘要

热带、亚热带玉米种质具有丰富的遗传变异性,对其改良和利用是拓宽我国种质资源的有效途径。然而,影响其在温带地区利用的最主要限制因素就是光周期敏感性。因此,分离、克隆玉米光周期敏感相关基因并探知其功能,从分子水平揭示玉米光周期敏感现象、钝化光周期敏感性,对热带、亚热带玉米种质的有效利用具有重要的理论和实践意义。本研究以热带玉米自交系CML288和温带玉米自交系黄早4为材料,利用同源克隆的方法克隆了与拟南芥ELF4、水稻OsELF4基因同源的玉米ZmELF4基因;利用荧光定量PCR技术,研究了不同材料相同光照、同一材料不同光照、不同组织、不同的发育阶段以及其在非光周期条件下ZmELF4基因的表达规律,分析了ZmELF4基因与ZmCOL和ZmCCA1的关系;构建了ZmELF4基因的融合表达载体及过量表达载体,并分别通过洋葱表皮瞬时表达实验进行了亚细胞定位研究,通过农杆菌介导花序侵染法进行了过量表达转基因功能验证。主要研究结果如下:1.利用基因同源克隆技术,首次克隆了玉米的ZmELF4基因,GenBank登录号为HQ009862。该基因序列中不存在内含子,但是在5’非编码区DNA序列中有一段约169bp的插入序列,而cDNA序列中没有该段序列。获得的cDNA序列全长约680bp,含有432bp的开放性阅读框,推测其编码一条含有144个氨基酸的肽链。系统进化树分析发现,ZmELF4与水稻OsELF4位于同一进化分枝,其亲缘关系最近。蛋白结构预测显示其含有保守的未知功能的DUF1313结构域,推测其是ELF4/OsELF4的同源基因。2.应用实时荧光定量PCR研究了ZmELF4基因在CML288和黄早4中,在长短日照两种处理条件下的昼夜节律表达规律及其在不同组织、不同的发育阶段的表达规律,分析了ZmELF4基因与拟南芥CCA1和CO在玉米中的同源基因ZmCCA1、ZmCOL的表达关系。结果表明,无论是CML288还是黄早4,长短日照条件下,在叶片与茎尖中ZmELF4基因的表达都呈现出节律性,当把植株挪移到连续光照条件下后这个节律仍然不变,只是表达的振幅逐渐降低而已,并且两种材料在相应的长短日照条件下表达高峰时期一致,只是整体表达量不同;在玉米的不同发育阶段、不同组织ZmELF4也都表达,但是两种材料中的表达又明显存在差异;此外,将ZmELF4的表达规律与ZmCCA1和ZmCOL的表达规律相比较发现,它们之间存在密切的关系,并且ZmELF4与ZmCOL的表达高峰都处在光周期诱导开花的敏感时期内,推测ZmELF4可能与两者相互作用,通过某种途径共同调控玉米光周期诱导开花的过程。3.利用基因重组技术,成功构建了带有GFP标记的融合表达载体pGIT-ZmELF4-GFP和能够高效表达的过量表达载体pBI-ZmELF4,通过洋葱表皮瞬时表达实验对ZmELF4进行了亚细胞定位研究,结果将其定位于细胞核;通过农杆菌介导花序侵染法将过量表达载体pBI-ZmELF4导入拟南芥进行间接功能验证,获得了7株阳性转化苗,且转化苗的开花期平均比野生型拟南芥推迟了25天左右,叶片数也比野生型多10片。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 文献综述
• 1. 植物的光周期现象及其分子机制的研究进展
• 1.1 光周期及光周期敏感现象
• 1.2 光周期中光期和暗期的作用
• 1.3 拟南芥光周期作用分子机制的研究进展
• 1.3.1 光受体
• 1.3.2 生物钟组分
• 1.3.3 下游的转录调控因子
• 1.3.4 成花信号综合子
• 1.3.5 抑制因子
• 1.4 水稻光周期作用分子机制的研究进展
• 2. 玉米光周期敏感现象的研究进展
• 2.1 玉米光周期敏感现象
• 2.2 玉米光周期敏感指标及特性
• 2.3 玉米光周期敏感时期的研究
• 2.4 玉米光周期敏感相关基因的定位研究
• 2.5 玉米光周期敏感相关基因的克隆与研究
• 3. 拟南芥ELF4 基因及其在其它物种中同源基因的研究进展
• 3.1 拟南芥ELF4 基因的研究进展
• 3.2 ELF4-like 基因在其它物种中同源基因的研究进展
• 4. 同源序列克隆法
• 4.1 基因同源序列克隆法的原理
• 4.2 同源序列克隆法的优点及存在的问题
• 5. 实时荧光定量PCR 技术
• 5.1 实时荧光定量 PCR 技术原理
• 5.2 实时荧光定量 PCR 技术的优点
• 6. 亚细胞定位技术
• 6.1 免疫荧光技术
• 6.2 免疫胶体金标记
• 6.3 融合报告基因定位法
• 7. 拟南芥转基因方法的研究
• 第二章 玉米光周期敏感基因ZmELF4 的克隆
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 总 RNA 的提取与纯化
• 1.3.2 DNA 的提取与纯化
• 1.3.3 cDNA 第一链的合成
• 1.3.4 玉米ZmELF4 基因片段的克隆
• 1.3.4.1 玉米ZmELF4 基因的PCR 扩增
• 1.3.4.2 玉米ZmELF4 基因PCR 扩增产物的回收、连接与转化
• 1.3.5 测序结果分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 RNA 提取、纯化、第一链合成及检测
• 2.2 玉米ZmELF4 基因的克隆与分析
• 2.2.1 玉米ZmELF4 基因的克隆
• 2.2.2 玉米ZmELF4 基因序列分析
• 2.2.2.1 CML288 和黄早4 中ZmELF4 基因cDNA、DNA 和氨基酸序列的比较分析
• 2.2.2.2 ZmELF4 基因的序列分析
• 2.2.2.3 玉米ZmELF4 基因的氨基酸序列分析
• 2.2.2.4 玉米 ZmELF4 基因的两种转录方式
• 3. 讨论
• 3.1 玉米ZmELF4 基因是ELF4/OsELF4 基因的同源基因
• 3.2 玉米ZmELF4 基因下一步亟待需要探讨的问题
• 第三章 玉米ZmELF4 基因及其相关基因的表达分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 光周期处理与取样
• 1.3 试剂与仪器
• 1.4 方法
• 1.4.1 总 RNA 的提取与纯化
• 1.4.2 cDNA 第一链的合成
• 1.4.3 荧光定量 PCR 引物的设计
• 1.4.4 标准品的制备和标准曲线的建立
• 1.4.5 样品检测与数据处理
• 2. 结果与分析
• 2.1 基因标准曲线的建立
• 2.2 基因表达模式的研究
• 2.2.1 ZmELF4 基因的节律表达模式
• 2.2.2 ZmELF4 基因不同生长发育阶段在叶片与茎尖中的表达规律
• 2.2.3 ZmELF4 基因在玉米不同组织部位的表达
• 2.2.4 ZmELF4 基因与ZmCCA1 基因的表达关系
• 2.2.5 ZmELF4 基因与ZmCOL 基因之间的表达关系
• 3. 讨论
• 3.1 ZmELF4 基因周期表达模式及与ZmCCA1 基因之间的表达关系的探讨
• 3.2 ZmELF4 与ZmCOL 相互作用共同调控玉米光周期诱导开花的过程
• 3.3 玉米ZmELF4 基因在表达水平上需要进一步探讨的问题
• 第四章 玉米ZmELF4 基因的初步功能验证
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 酶和试剂
• 1.3 菌株与质粒载体
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 实验方法
• 1.5.1 亚细胞定位实验方法
• 1.5.1.1 融合表达载体的构建
• 1.5.1.2 轰击前洋葱表皮的培养
• 1.5.1.3 金粉悬液制备
• 1.5.1.4 微弹制备（6 枪量）
• 1.5.1.5 基因枪轰击前操作
• 1.5.1.6 基因枪轰击操作步骤（PDS-1000/He 型基因枪）
• 1.5.1.7 轰击后洋葱表皮的培养
• 1.5.1.8 荧光显微镜观察
• 1.5.2 拟南芥过量表达实验
• 1.5.2.1 过量表达载体的构建
• 1.5.2.2 拟南芥转化
• 1.5.2.3 转基因拟南芥的筛选鉴定
• 1.5.2.4 转基因拟南芥植株的表型鉴定
• 2. 结果与分析
• 2.1 融合表达表达载体的构建
• 2.2 洋葱表皮瞬时表达结果
• 2.3 ZmELF4 基因过量表达载体的构建
• 2.4 重组质粒PBI-ZmELF4 转化农杆菌
• 2.5 转基因拟南芥的筛选
• 2.6 转基因拟南芥的PCR 验证
• 2.7 转基因拟南芥的表型观察与比较
• 3. 讨论
• 3.1 玉米ZmELF4 是核定位蛋白
• 3.2 玉米 ZmELF4 基因具有与拟南芥ELF4 基因相似的功能
• 3.3 玉米ZmELF4 基因在功能验证上需要进一步探讨的问题
• 参考文献
• ABSTRACT