论文摘要
肾脏固有细胞的增殖、分化和凋亡及细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的合成和降解在维持正常肾脏功能和肾脏疾病发生发展中起着极其重要的作用。组织基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1，TIMP-1），能广泛地抑制组织基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）的活性，调节ECM的动态平衡。近年来研究发现，TIMP-1还具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、调节组织新生血管的形成和影响机体免疫力等重要作用。JAKs（Just another kinases：Januskinases）／STATs（signal transductors and activator of transcriptions）信号传导通路在细胞增殖、凋亡的调控中也具有重要作用。我们前期的研究发现，TIMP-1可经过PI3K／AKT、MEK／ERK等细胞信号传导通路起到抑制细胞凋亡的作用。但JAKs／STATs通路是否参与TIMP-1抑制大鼠肾小球系膜细胞（rat glomerular mesangial cell，RMC）凋亡，目前尚不清楚。本实验第一部分以RMC作为研究对象，来探讨TIMP-1抑制RMC凋亡是否与JAKs／STATs细胞因子信号传导通路有关。用人正、反义TIMP-1重组真核表达载体转染RMC，在无血清条件下，使用JAK2的特异性抑制剂AG490（50μmol／L）刺激24h，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况；逆转录聚合酶链式扩增（RT-PCR）观察TIMP-1、Cyclin D1、Bcl-x1、P27kip1和JAK2 mRNA的表达：Western blot检测胞浆中JAK2、STAT3、STAT5和其对应的磷酸化蛋白的表达。结果发现：1、未加AG490的未转染组、正义TIMP-1转染组及反义TIMP-1转染组细胞总凋亡率分别为（10.59±0.96）％、（7.08±0.43）％和（21.91±0.25）％：正义转染组总凋亡率明显低于未转染组（P＜0.05），反义转染组总凋亡率则显著高于未转染组（P＜0.01）。加入AG490后，各组细胞的总凋亡率均明显增加（P＜0.01）。2、RT-PCR检测结果显示：在无血清条件下，未加AG490的各组细胞中，Cyclin D1、Bcl-x1 mRNA在正义TIMP-1转染组中最高，反义TIMP-1转染组中最低：P27kip1mRNA在反义TIMP-1转染组中表达最高。加入AG490后，各组细胞TIMP-1、Cyclin D1和Bcl-x1 mRNA表达均减少，P27kip1 mRNA均增加。3、Western blot结果显示：在无血清环境中，未加AG490的各组细胞中，P-JAK2、P-STAT3和P-STAT5在正义TIMP-1转染组中表达最高，在反—TIMP-1转染组中最低：加入AG490后，上述蛋白表达较相应未加AG490的组均明显减少。以上结果提示：在无血清条件下，TIMP-1可在蛋白水平上反馈激活JAKs／STATs信号通路，抑制RMC发生凋亡。近年来，糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）的发病率在我国逐年上升。随着病程的延长，往往累及全身多个器官，引起多种严重的并发症，糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）就是其中之一。近年来的研究表明，高糖（High Glucose，HG）长期作用于肾脏，可引起肾脏氧化应激（Oxidative Stress，OS），通过JAKs／STATs信号通路，可加重肾脏纤维化的病理改变。TIMP-1抑制MMPs活性和刺激细胞增殖抑制细胞凋亡的作用，可促进组织纤维化的发生发展。但在DN的OS机制中，是否存在TIMP-1的参与，目前尚不清楚。本实验第二部分探讨HG条件下OS、JAKs／STATs信号通路和TIMP-1之间的关系。在HG条件下，RMC分别使用NADPH氧化酶和JAK2的特异性抑制剂DPI和AG490刺激24h，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况；RT-PCR观察Bcl-x1、Cyclin D1、P27kip1、JAK2和TIMP-1 mRNA的表达；Western blot检测胞浆中JAK2、STAT3、STAT5和其对应的磷酸化蛋白的表达。结果显示：1、HG组（25mmol／L）、HG+AG490组（HG 25mmol／L+AG49050μmol／L）、HG+DPI组（HG 25mmol／L+DPI 0.32μmol／L）和HG+AG490+DPI组（HG 25mmol／L+AG490 50μmol／L+DPI 0.32μmol／L）的细胞总凋亡率分别为：（10.69±0.26）％、（20.52±0.51）％、（24.56±0.36）％和（26.01±0.28）％：与HG组相比，加入AG490或（和）DPI可显著提高RMC总凋亡率。2、RT-PCR结果显示：AG490或（和）DPI可使Bcl-x1、Cyclin D1、JAK2和TIMP-1 mRNA表达显著减少，使P27kip1 mRNA表达增加：同时可明显增加（P27kip1mRNA／actin）／（Cyclin D1 mRNA／actin）的比值。3、Western blot结果显示：AG490或（和）DPI可使各组RMCP-JAK2、P-STAT3和P-STAT5的表达显著减少。由以上可知，HG可经反应性氧化物（reactive oxidative species，ROS）活化JAKs／STATs信号通路；阻断OS或JAKs／STATs通路，可使RMC TIMP-1 mRNA表达减少。
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标签：大鼠肾小球系膜细胞论文; 凋亡论文;