论文摘要
目的:本研究观测烟草浸提液(smokeless tobacco extract,ST)和尼古丁(nicotine)对人牙龈成纤维细胞(Human Gingival Fibroblasts,HGFs)在钛板上附着数目、形态、增殖及分泌胶原的影响,从细胞水平探讨烟草对种植体龈界面破坏的理论机制。方法:实验1、采用组织块法进行HGFs的原代培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。取第3代HGFs用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase,SP)进行波形丝蛋白(cytokeratin,CK)和角蛋白(vimentin,V)染色以鉴定细胞来源,用血球计数板计数法记录细胞的生长曲线。实验2、将厚度1mm、直径10mm的钛板用金相砂纸逐级打磨。反射光显微镜、扫描电镜观测钛板表面形态。表面粗糙度测量仪测量钛板表面粗糙度,以Ra值表征。实验3、将消毒备用的钛板置于24孔板中,加入含0、0.01、0.1、1、5、10g/L ST和0.03、0.15、0.3g/L尼古丁(9种浓度)的细胞悬浮液。孵育2小时后,MTT法测定钛板表面粘附细胞数;孵育24小时后,计算机图像分析系统测定钛板表面细胞铺展形态的变化。不含处理因素的细胞悬浮液接种于预先放置在24孔板内的钛板表面,孵育24小时后,更换含0、0.01、0.1、1、10g/L ST和0.03g/L尼古丁(6种浓度)的培养液常规培养,在第1、4、7、10天行MTT法测定细胞增殖率。实验4、取细胞悬浮液接种于24孔板内钛板表面,孵育24小时后,更换含0、0.01、0.1、1、5、10、25g/L ST和0.03、0.15、0.3g/L尼古丁(10种浓度)的培养液。继续孵育48小时后,吸取出24孔板内的培养液,检测细胞培养上清液中羟脯氨酸含量。结果:1、HGFs最早在第3d从组织块中爬出,大多呈梭形。一般2~3周长满瓶底,可进行传代。SP免疫组化染色结果显示HGFs波形丝蛋白染色为阳性,角蛋白染色为阴性,提示该细胞来源于中胚层,非上皮来源性细胞。HGFs生长曲线略呈“S”形,接种后第1天细胞数略有下降,随后生长逐渐加快,这种状态持续至第5d。第6d开始进入平台期,细胞生长速度减缓。2、打磨后的钛板表面呈规则沟嵴相间的表面形貌,其表面粗糙度测量Ra值为0.1022±0.00766μm。3、MTT法测2小时钛板表面粘附细胞数表明,ST和尼古丁均可抑制牙龈成纤维细胞在钛板表面的附着,且抑制作用随着ST或尼古丁浓度的增加而增强。控制组(0g/L ST)与0.01、0.1、1g/L ST 0.03g/L尼古丁组比较,统计分析差异无显著性(P>0.05)。而控制组与5、10、25g/L ST和0.15、0.3g/L尼古丁组比较时,统计分析差异有显著性(P<0.05)。HGFs在钛板表面粘附24小时后,表现为扁平的纺锤形,沿着划痕方向伸展。ST和尼古丁均可抑制HGFs在钛板表面的伸展,且随着ST或尼古丁浓度的增加,细胞伸展面积逐渐减小,形态逐渐变为圆形。MTT法测1d、4d、7d、10d细胞在钛板表面的增殖结果表明,ST或尼古丁可抑制HGFs在钛板表面的增殖,且抑制的强弱与剂量相关。当ST的浓度为10 g/L时,细胞的增殖完全被抑制。4、ST和尼古丁可抑制HGFs胶原的合成,且抑制的强弱与ST和尼古丁的剂量相关。结论:1、牙龈成纤维细胞体外培养成功率较高,可为本实验的研究提供足够的细胞。2、处理后的钛板表面呈现规则的形貌,粗糙度在临床常用种植体基桩表面粗糙度的范围内,适于细胞附着。3、ST和尼古丁均可抑制HGFs在钛板表面的粘附、形态伸展及其增殖,且抑制强弱与剂量呈正相关。4、ST和尼古丁均可抑制钛板上HGFs胶原合成,且抑制强弱与剂量呈正相关。
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