茶陵野生稻抗冻相关转录因子的克隆以及抗冻机理的研究

论文摘要

野生稻中蕴藏着丰富的抗病虫、抗逆、抗低温、耐干旱、耐贫瘠等抗逆优良性状基因,在现代水稻抗性育种中具有独特的作用。当今一些模式植物如拟南芥的DREB转录因子的分子生物学研究取得了良好的进展,DREB转录因子的表达受非生物逆境胁迫,如干旱、高盐、低温、冻害等逆境胁迫的诱导,在植物对逆境胁迫与激素应答反应中发挥调控作用。本研究以茶陵野生稻为材料,针对DREB转录因子开展了研究,在低温胁迫下通过分离野生稻的总RNA并反转录成cDNA,克隆了茶陵野生稻中DREB转录因子,全长958bp,编码218个氨基酸,经BLAST及蛋白质同源性分析,该序列与水稻（Oryza sativa） DREB基因的同源性98%,与小麦（Triticum monococcum） CRT/DREB4蛋白的同源性为93%；与大麦（Hordeum vulgare）CBF2A蛋白与CBFIVc-14.1蛋白分别为93%、92%。这表明已经成功克隆了野生稻中DREB转录因子序列。为了进一步研究DREB在不同时间低温胁迫下茶陵野生稻组织中的表达情况,以水稻基因组DNA中的内参Actin序列作为内参基因,应用RT-PCR技术对DREB转录因子的表达进行半定量分析,结果显示在不同时间的低温胁迫条件下,DREB基因的表达有组织特异性,且在根中的表达更为稳定,表达量最高。通过PCR将DREB转录因子从T载体上释放,构建至植物表达载体pWM101载体中。通过对低温胁迫下茶陵野生稻中的各种生化酶的检测,以栽培稻作为对照,分别测定在低温不同积累时间下的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性,结果发现,野生稻体内酶的活性比栽培稻要高,当胁迫累积到24小时之后,酶活性依然能保持在较高的水平,与转录因子不同时间的低温胁迫下的表达量的高低在一定程度上有相似性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 野生稻研究现状
• 1.1 野生稻抗性资源概述
• 1.2 展望
• 2 转录因子的结构与分类
• 2.1 转录因子
• 2.2 植物转录因子的分类
• 2.3 植物转录因子的结构
• 2.4 转录因子的调控
• 3 DREB转录因子的研究进展
• 4 立题意义
• 第二章 茶陵野生稻DREB转录因子的克隆及序列分析
• 1 前言
• 2 材料和试剂
• 2.1 实验材料
• 2.2 试剂和仪器
• 3 实验方法
• 3.1 材料的处理
• 3.2 茶陵野生稻总RNA的提取
• 3.3 目的基因的克隆
• 3.4 PCR产物的回收纯化以及与PMD-18载体的连接
• 3.5 连接产物的转化
• 3.6 目的基因的检测和测序
• 3.7 序列分析
• 4 结果与分析
• 4.1 野生稻总DNA的提取
• 4.2 目的基因的克隆
• 4.3 目的基因的检测
• 4.4 序列分析
• 5 讨论
• 第三章 茶陵野生稻DREB转录因子的表达特性分析及植物表达载体的构建
• 1 材料和试剂
• 1.1 酶和试剂
• 1.2 器具准备
• 2 实验方法
• 2.1 材料的低温胁迫处理
• 2.2 不同组织总RNA的提取和纯化
• 2.3 RT-PCR
• 2.4 植物表达载体的构建
• 3 结果分析
• 3.1 野生稻RNA的提取
• 3.2 RT-PCR退火温度与循环次数
• 3.3 OREB基因表达特性分析
• 3.4 植物表达载体pWM101的构建和检测
• 4 讨论
• 第四章 茶陵野生稻低温胁迫下生理生化机制的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试剂配制
• 1.3 实验方法
• 2 结果分析
• 2.1 过氧化氢酶活性检测
• 2.2 过氧化物酶活性检测
• 2.3 超氧化物歧化酶活性检测
• 3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介