论文摘要
目的:细胞是组织构建的基础,目前种子细胞的体外扩增需要3周左右时间,体外构建组织工程骨要想满足临床需要,如何使种子细胞大量,快速,优质扩增是面临的首要问题。本实验室前期工作证明,特定参数的脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields,PEMFs）能够对人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）的增殖产生促进作用,并诱导成骨。然而刺激的频率不同,是否会对细胞增殖及分化产生不同的影响?在组织工程骨的体外构建中我们应该选择怎样的合适频率范围?细胞是以群体而不是以孤立的形式生长,细胞间存在物质和信息交换,脉冲电磁场是否会对缝隙连接细胞间通讯（Gap junctional intercellular com-munication ,GJ IC ）功能产生影响,进而影响细胞增殖分化?这些问题尚缺乏系统的研究。本研究旨在探讨不同频率段PEMFs刺激对hMSCs体外增殖分化的作用,以期找出适合的频率范围,为应用PEMFs促进hMSCs快速大量优质扩增,诱导成骨分化,研制新型生物反应器,以及进一步研究PEMFs刺激对MSCs生物学效应的机制提供实验依据。方法:1、频率分组:选择1-150Hz 频率范围,将体外培养的第三代hMSCs 分为5、25、50、75、100、150HzPEMF 刺激组和不施加PEMF 的对照组。2、参数选择:脉冲电磁场刺激强度1.1mT,时间30min/d,持续作用21 天。3、倒置相差显微镜观察细胞形态。4、四氮噻唑盐（MTT）比色法检测hMSCs 的增殖,绘制细胞生长曲线。5、流式细胞仪检测hMSCs 细胞周期。6、酶化学法测定细胞碱性磷酸酶（ALP）活性。7、放免法测定细胞骨钙素的分泌情况。9、茜素红钙染色检测钙结节的形成。9、透射电镜观察hMSCs 超微结构,观察细胞间缝隙连接。10、采用荧光光漂白恢复（Fluorescence redistribution after photobleaching ,FRAP） 技术,通过激光共聚焦显微镜检测hMSCs 经PEMF 刺激后的缝隙连接功能（GJ IC）变化。结果:1、经PEMF刺激的hMSCs,3d后密度较对照组增高,体积逐渐增大,形态变为三角形、多角形、鳞形,胞浆中含有较多的基质成分和颗粒状物质。不同频率的PEMF作用组间细胞形态无明显差别。随培养时间延长,细胞逐渐汇合呈铺路石状,进而出现重叠生长,基质堆积,3周后基质矿盐沉积并融合成圆形或卵圆形的钙化结节。2、MTT
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