BmCPV与BmNPV多角体对异源蛋白的包埋特性研究

论文摘要

家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV）和家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV）是感染家蚕分别引起中肠型脓病和血液型脓病的病原。昆虫病毒的多角体对包埋的病毒粒子具有很好的保护作用。为了深入了解多角体的包埋特性,探索多角体的包埋机制,本研究主要开展了BmCPV与BmNPV多角体对异源蛋白的包埋特性研究。1、BmCPV多角体蛋白组学研究利用LC-MS/MS对从患病家蚕中肠纯化的BmCPV多角体进行了蛋白组学研究,共鉴定了28种蛋白质,其中23种蛋白质来自宿主家蚕,显示在BmNPV多角体形成过程中宿主蛋白可以被包埋进BmCPV的多角体中。对这23种家蚕蛋白的分子结构分析发现,部分蛋白的结构与BmCPV多角体蛋白的结构或病毒结构蛋白VP3的N末端结构有相似之处,推测BmCPV多角体对宿主蛋白的包埋与相互之间蛋白结构相似有关。2、稳定转化细胞表达BmCPV多角体蛋白及其包埋蛋白分析将带有BmCPV多角体蛋白基因的表达载体pIZT/V5-His-polh转染BmN细胞,经抗生素Zeocin筛选获得稳定表达多角体蛋白的转化细胞株。荧光观察显示,转化细胞的细胞质中有呈绿色荧光的病毒多角体,但纯化后的多角体无明显的绿色荧光,表明BmCPV的多角体蛋白在无其它病毒蛋白的存在下可自我装配成多角体,荧光蛋白没有被多角体包埋。串联质谱分析结果发现,纯化的多角体中存在2种来自家蚕的泛素与核糖体蛋白S27a（ubiquitin and ribosomal protein S27a）和BTB/POZ蛋白（BTB/POZ domain containing protein）,结构分析显示,这2种蛋白的三级结构与BmCPV多角体蛋白的左手结构呈现一定的相似性,推测多角体蛋白可以与结构相似的蛋白相互作用并对其进行包埋;以修饰型线性家蚕杆状病毒BmPAK6感染稳定转化细胞,回复感染结果显示,纯化的多角体裂解液对BmN细胞具感染性,表明BmCPV多角体能包埋异源病毒粒子BmPAK6;纯化的多角体及多角体裂解液能使X-gal显色呈色,表明β半乳糖苷酶能被质型多角体包埋。3、BmNPV ODV蛋白组学研究用LC-MS/MS对从血液型脓病蚕血液中纯化的BmNPV的ODV进行了蛋白组学研究,共鉴定了37种蛋白质,其中27种蛋白为BmNPV自身编码,10种蛋白为家蚕编码,并发现多角体中存在部分病毒非结构蛋白,表明BmNPV多角体在宿主体内组装过程中,可以对宿主蛋白进行包埋。4、稳定转化细胞表达BmNPV多角体蛋白将带有BmNPV多角体蛋白基因的重组表达载体pIZT/V5-His-polh转染BmN细胞,经抗生素筛选获得了稳定表达BmNPV多角体蛋白的转化细胞,荧光显微镜观察显示,在转化细胞的细胞核内存在具荧光的多角体颗粒,细胞核膨大,出现类似BmNPV感染的细胞病变,表明多角体蛋白在细胞内可自主装配,并引起细胞产生病理变化。以上研究结果为进一步探讨多角体蛋白对病毒粒子及异源蛋白的包埋机制提供了新的方法和线索,并为利用多角体蛋白对异源蛋白的包埋特性提供了新的技术和途径。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 质型多角体病毒的研究进展
• 1 质型多角体病毒的发现
• 2 质型多角体病毒的分类与命名
• 3 质型多角体病毒对昆虫的侵染
• 3.1 昆虫质型多角体病毒病的典型病症
• 3.2 质型多角体病毒的发育循环复制机制
• 3.3 质型多角体病毒的混合发生
• 3.4 质型多角体病毒的交叉感染
• 4 CPV 病毒粒子
• 5 CPV 多角体的相关研究
• 5.1 CPV 多角体的形成
• 5.2 CPV 多角体的结构
• 5.3 CPV 多角体的性能
• 6 质型多角体病毒的应用与展望
• 参考文献
• 第二章 核型多角体病毒研究进展
• 1 杆状病毒简介
• 2 杆状病毒的分类
• 3 杆状病毒的发育循环
• 4 杆状病毒两种病毒粒子表型
• 5 NPV 多角体
• 5.1 NPV 多角体的理化性质
• 5.2 NPV 多角体的结构
• 5.3 NPV 多角体的包埋作用
• 参考文献
• 第二部分 研究报告
• 第三章 研究目的与研究内容
• 1 研究目的与意义
• 2 研究内容与技术路线
• 2.1 主要研究内容
• 2.2 研究技术路线
• 第四章 实验材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 材料
• 1.2 细菌培养基
• 1.3 昆虫细胞培养基
• 1.4 分子克隆常用缓冲液及溶液配制
• 1.5 SDS-PAGE 常用缓冲液及溶液配制
• 2. 实验常用仪器设备
• 3. 实验方法
• 3.1 感受态细胞的制备
• 3.2 重组DNA 的转化
• 3.3 碱裂解法制备质粒DNA
• 3.4 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）
• 3.5 连接反应
• 3.6 酶切反应
• 3.7 BmN 细胞培养和保存
• 3.8 BmN 细胞的转染
• 3.9 多角体病毒的纯化
• 3.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 第五章 家蚕质型多角体病毒（BmCPV）蛋白组学研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 BmCPV 多角体的纯度鉴定
• 3.2 纯化多角体的感染性检测
• 3.3 BmCPV 蛋白的SDS-PAGE 及质谱分析与蛋白鉴定
• 3.4 多角体内部包埋蛋白的结构分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 第六章 BmCPV 多角体蛋白的细胞表达及包埋蛋白分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 BmN 细胞转染及筛选
• 3.2 多角体的纯化及蛋白鉴定
• 3.3 多角体内部包埋蛋白的结构分析
• 3.4 多角体包埋异源蛋白及异源病毒的检测
• 4 讨论
• 参考文献
• 第七章 家蚕核型多角体病毒（BmNPV）蛋白组学分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 ODV 的纯化
• 3.2 病毒感染性检测
• 3.3 BmNPV 蛋白的 SDS-PAGE 及质谱分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 第八章 稳定转化细胞表达BmNPV 多角体蛋白
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 pIZT/V5-His-polh 载体的鉴定
• 3.2 转染细胞的筛选
• 3.3 多角体的纯化及SDS-PAGE 分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 结论
• 1 已取得的成果
• 2 有待进一步研究的问题
• 附录一 英文简写对照表
• 附录二 攻读硕士学位期间发表的文章
• 致谢