论文摘要
目的：1.体内实验探讨十溴联苯醚（brominated diphenyl ethers-209, BDE-209）对小鼠卵巢储备功能的影响；2.采用机械分离,胰蛋白酶消化与低速离心相结合的方法分离培养小鼠卵巢颗粒细胞。研究其在体外的生物学特征,为后续实验提供理想的细胞来源。3.体外实验观察BDE-209对小鼠卵巢颗粒细胞增殖发育的影响。方法：1.出生20天左右昆明小鼠随机分为两组。对照组：胃灌纯花生油；实验组：胃灌含0.003 g/mL BDE-209花生油。胃灌30天后阴道涂片于动情间期处死小鼠。观察小鼠生长发育、脏器系数、动情周期、血清性激素水平、卵巢卵泡发育及组织形态学改变等结果。2.通过对性成熟未孕雌性昆明小鼠进行孕马血清促性腺激素（pregnant mare serumgo-nadotropin, PMSG）处理后,应用机械分离,胰蛋白酶消化以及低速离心相结合的方法获得小鼠卵巢颗粒细胞。流式细胞仪鉴定细胞纯度,细胞形态学观察,MTT检测细胞增殖能力,描绘生长曲线等观察体外培养小鼠卵巢颗粒细胞的生物学特性。3.将不含BDE-209的培养基作为对照组A,含10、20、40μg/mL BDE-209的培养基作为实验组B、C、D。分别处理卵巢颗粒细胞24 h, CCK-8检测细胞的增殖抑制率；原子力显微镜观察细胞表面结构及细胞核表面情况。结果：1.BDE-209染毒可造成小鼠体重增长减缓。随着胃灌时间的延长,实验组体质量较对照组低（P<0.05,P<0.01）。实验组小鼠子宫质量较对照组低（P<0.05）,但卵巢质量及脏器系数均没有差异（P>0.05）。2.BDE-209染毒可造成小鼠血清中雌二醇（estradiol,E2）和卵泡刺激素（follicle stimu-lating hormone,FSH）含量降低（P<0.05）；促黄体生成素（luteinizing hormone,LH）及FSH/LH没有明显变化（P>0.05）。实验组中部分小鼠动情周期紊乱,动情后期及动情间期反复,有3只小鼠连续14天没有出现动情期。3.BDE-209染毒可造成卵巢原始卵泡及初,次级卵泡减少,闭锁卵泡增多。实验组颗粒细胞数量减少,弥漫性结构疏松,轮廓不清,胞核大小不一,颗粒细胞与膜细胞间隙增宽。4.机械分离,胰酶消化与低速离心相结合的方法,每6只小鼠大约可以获得106个纯度约85%的小鼠卵巢颗粒细胞。体外培养卵巢颗粒细胞的生物学特性：原代小鼠卵巢颗粒细胞接种24 h后大部分存活细胞贴壁；48 h后细胞明显增殖,贴壁良好,生长旺盛；72 h后细胞生长极度旺盛,呈对数生长趋势,铺路石样生长,具干细胞式聚集生长特性。5.通过CCK-8检测发现外源性BDE-209对小鼠卵巢颗粒细胞的增殖具有抑制作用,BDE-209在浓度10μg/mL时细胞增殖抑制率无明显上升（P>0.05）；中,高浓度（20 mL,40 fig/mL）时细胞增殖抑制率较对照组明显增高（P<0.01）6.原子力显微镜观察小鼠卵巢颗粒细胞形态：正常的小鼠颗粒细胞形态比较规整,胞核完整,细胞高度也相似,但是随着BDE-209染毒浓度的增加,细胞核破坏明显,核碎,核裂增多,细胞塌陷,没有细胞的正常形态。结论：1.连续30天胃灌雌性小鼠BDE-209后,小鼠生长发育受抑制,小鼠卵巢储备功能降低,卵泡发育障碍,颗粒细胞减少,排列紊乱。2.机械分离,胰酶消化与低速离心相结合的方法,可以稳定的获得大量,纯化的小鼠卵巢颗粒细胞。3.BDE-209对小鼠卵巢颗粒细胞的生长具有抑制作用并且存在剂量效应关系。4.BDE-209造成小鼠卵巢颗粒细胞表面结构改变,细胞核损伤。5.结合体内外实验可知,BDE-209对小鼠卵巢储备功能的却具有不利影响。