论文摘要
中药化学成分的生理活性研究是近年来中药研究的重点内容。随着对中药研究的深入,许许多多的单体化合物被从中药中分离和鉴定出来,虽然有些化合物的部分生理活性已经得到阐明,但是大多数化合物的活性研究还是不够,致使很多中药单体成分被闲置起来,没有很好的发挥它应有的价值,从而造成极大的浪费。本文选择中药蜈蚣三七化学成分作为研究对象,运用体外细胞培养和细胞造模的方式,对蜈蚣三七4个单体化合物的活性进行了系统的研究和分析,从而找出它们的功效和结构之间的关系。蜈蚣三七是毛莨科银莲花属植物林荫银莲花(Anemone flaceidaFr.Schmidt)的干燥根茎,又名鹅掌草,多分布于华南地区,湖北宜昌地区也有分布。其功用为祛风湿、助筋骨,用于治疗风湿痛疼、跌打损伤。大量的药理学实验表明,蜈蚣三七抗风湿的有效部位主要为三萜皂苷类成分,于是经过水煮醇沉,大孔吸附树脂纯化得到蜈蚣三七提取物。以蜈蚣三七提取物(主要为三萜皂苷类成分)为原料制成的五类新药经过动物实验、Ⅰ、Ⅱ期临床实验证明,其抗风湿效果明显,而且具有毒副作用小的特点,现正在实施Ⅲ期临床实验。为了确定其抗炎、解热镇痛的有效化学成分组成,我们已经通过分离鉴定获得了主要的5个三萜皂苷类成分,分别命名为W0a、W0b、W1、W2,并且建立了HPLC法测定含量的方法,由于W2得到的量不足,本论文只对前4种化合物进行了活性的研究和比较。类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是最常见和致残率最高的骨关节疾病之一,主要病理环节包括免疫功能失常,关节滑膜细胞积聚与滑膜增厚,关节软骨和骨破坏三个反面。淋巴细胞过度增殖,免疫功能紊乱是RA发病的主要表现。当受到外原性抗原刺激时,淋巴细胞活化并增殖,其结果就是针对抗原特异性的克隆发生扩增。ConA诱导的淋巴细胞增殖和活化与抗原诱导的特异性克隆扩张是一致的,所以,由ConA诱导的T淋巴细胞增殖可以视为机体免疫应答能力的反应。通过细胞培养,使用ConA刺激淋巴细胞增殖,采用MTT法进行检测,发现总苷、W1、W3对ConA诱导的淋巴细胞增殖具有抑制作用,对正常淋巴细胞增殖无影响,这可能是对其高效低毒的一种反映,而雷公藤片对正常的和conA诱导的淋巴细胞增殖都具有抑制作用,说明雷公藤抗风湿可能是一种免疫抑制剂。RA是一种复杂的自身免疫性疾病,其特征是慢性的针对正常机体组织的T淋巴细胞反应。因此作为抑制T淋巴细胞活化的重要分子CTLA-4及sFas就被作为了研究重点。目前也已经发现这两种基因与多种T细胞介导的自身免疫疾病存在着相关性。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4,CTLA-4)是一种重要的共刺激信号抑制受体,在T细胞活化过程中,CTLA-4被逐渐的诱导出来,与其同源的共刺激信号受体CD28竞争结合B7,从而抑制了T细胞的进一步活化,使机体形成自身的免疫调控平衡。类风湿关节炎等自身免疫性疾病的发病与细胞凋亡的异常表达有关。细胞凋亡是细胞启动自杀程序后的一种死亡形式,在维持细胞正常死亡与分裂之间的平衡中起重要作用,Fas与FasL的结合可诱导细胞凋亡,sFas可中和掉FasL,能阻滞凋亡的发生,可以导致自身反应性的免疫细胞得不到清除而进攻自身组织,从而导致自身免疫病的发生,所以Fas系统介导的细胞凋亡也是我们研究的重点。本文使用有丝分裂原ConA激发淋巴细胞增殖,采用RT-PCR的方法,来检测药物对CTLA-4、sFas基因表达的影响,发现ConA刺激后CTLA-4、sFas表达均增强,而正常组几乎没有表达,总苷、W1、W3均能降低ConA诱导的淋巴细胞CTLA-4、sFas的表达,苷元、W0a、W0b、雷公藤组对此诱导均无显著影响。说明苷元本身对RA来说可能没有什么药理活性,只有按一定的顺序接上糖基后才会产生一定的生理活性,而且糖基的顺序以及数目均可能对功效产生一定的影响。