副干酪乳杆菌HD1.7prcK基因敲除载体构建及其电转化条件初步确立

论文摘要

本实验以副干酪乳杆菌HD1.7为研究对象,根据文献和GenBank中已登录的prcK基因和prcR基因全序列的保守区,设计合成多对引物,经多轮PCR扩增获得副干酪乳杆菌群体效应组氨酸蛋白激酶基因片段prcK-550。利用插入失活的方法,将prcK-550基因连接到pUC18上,构建重组质粒pUC18-prcK-550,然后用ClaI酶消化pUC18-prcK-550,使prcK-550基因内部发生单一位点的断裂,并在其中插入一个l.3kb的tet基因,成功构建基因敲除载体pUC18-prcK-550-tet,利用化学转化法将其导入E.coli DH5α,经四环素平板验证,具有四环素抗性。本实验采用可在阳性乳酸菌中复制的pMG36e作为质粒,对影响副干酪乳杆菌电转化的几个主要因素进行了初步研究,建立了较优化的电转条件:在电压1.8kV、细菌生长浓度A600为0.78的条件下,经1%甘氨酸处理受体菌并采用AEB1电转缓冲液能够得到较高的转化率。本实验旨在利用PCR方法克隆拟群体效应相关基因组氨酸蛋白激酶基因（prcK）,进而构建prcK基因敲除载体,并对HD1.7的电转化条件进行初步研究,为prcK基因缺失突变株及回复突变株的构建和进一步研究prcK基因的功能奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第1章 前言
• 1.1 细菌群体感应系统
• 1.1.1 细菌群体感应系统的发现
• 1.1.2 几种不同的QS 系统
• 1.1.3 副干酪乳杆菌的群体感应系统
• 1.2 基因敲除技术概述
• 1.3 乳酸菌遗传转化体系研究进展
• 1.3.1 用于转化的乳酸菌种类
• 1.3.2 乳酸菌的转化方法
• 1.3.3 乳酸菌电转化的影响因素
• 1.4 本课题研究的目的和意义
• 1.5 本研究的主要技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试菌种和质粒
• 2.1.2 扩增引物
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要分子生物学及生化试剂
• 2.1.5 主要缓冲液及试剂配制
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 pUC18-prcK-550-tet 自杀质粒载体的构建
• 2.2.2 副干酪乳杆菌电转化条件的研究
• 第3章 结果与分析
• 3.1 PUC18-PRCK-550-TET 自杀质粒载体的构建
• 3.1.1 副干酪乳杆菌HD1.7 基因组DNA 的提取
• 3.1.2 prcK 基因片段（prcK-280）的扩增
• 3.1.3 重组质粒pMD18-T-prcK-280 的筛选和鉴定
• 3.1.4 prcK 基因片段（prcK-480）的扩增
• 3.1.5 重组质粒pMD18-T-prcK-480 的筛选和鉴定
• 3.1.6 prcK 基因片段（prcK-550）的扩增
• 3.1.7 重组质粒pMD18-T-prcK-550 的筛选和鉴定
• 3.1.8 四环素抗性基因（tet）的扩增
• 3.1.9 重组质粒pMD18-T-tet 的筛选和鉴定
• 3.1.10 构建重组质粒pUC18-prcK-550
• 3.1.11 构建基因敲除载体pUC18-prcK-550-tet
• 3.2 副干酪乳杆菌电转化条件的研究
• 3.2.1 副干酪乳杆菌抗生素筛选浓度的确定
• 3.2.2 影响副干酪乳杆菌电转化的因素
• 第4章 讨论
• 4.1 克隆PRCK 基因片段（PRCK-550）的引物设计
• 4.2 PRCK 基因敲除载体的构建
• 4.3 酶切位点的设计
• 4.4 副干酪乳杆菌的电转化条件
• 4.5 工作设想
• 第5章 结论
• 5.1 副干酪乳杆菌群体效应组氨酸蛋白激酶基因片段（PRCK-550）的克隆
• 5.2 副干酪乳杆菌HD1.7PRCK 基因敲除载体的构建
• 5.3 副干酪乳杆菌 HD1.7 电转化条件的初步确立
• 参考文献
• 致谢