论文摘要
背景和目的大肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,且发病率有逐年增加的趋势,在美国是导致恶性肿瘤死亡的第二大原因,且每年的发病人数达到135,000人。随着我国人民生活水平的提高,膳食结构的改变,大肠癌的发病率也逐年提高,发病率已占恶性肿瘤的第三位,严重威胁人类的健康。目前绝大多数的大肠癌仍采取手术为主的综合治疗,随着治疗水平的提高,大肠癌的术后复发、转移逐步下降,但综合治疗的费用较高,副作用多,局部复发和肝转移仍然是治疗失败的主要原因,因此预防和早期发现局部复发和肝转移,筛选高危患者,预测复发和转移,以便及时治疗,对提高患者的生存质量和生存率具有重要的意义。随着分子生物学和基因工程的发展,基因治疗正成为肿瘤防治研究的重点。目前,肿瘤的基因治疗方法主要有基因替代,反义核酸技术,细胞因子基因治疗以及近年来最为关注的RNA干扰技术,肿瘤基因治疗的关键是找到合适的靶基因以及应用最先进的基因治疗手段。Survivin是新近发现的具有独特结构的凋亡抑制蛋白（IAP）家族的新成员,在许多恶性肿瘤中高表达,近年研究发现Survivin在正常大肠上皮细胞中不表达而在大肠癌中高表达,Survivin的表达上调与大肠癌的凋亡指数下降、总体存活率缩短、预后不良和复发率增加有关。鉴于它的独特的生物学特点,Survivin有望成为肿瘤基因治疗的理想靶点,许多研究显示降低它的表达影响肿瘤细胞的生物学活性,对肿瘤的治疗有利。RNA干扰是目前最有效的基因沉默技术,具有简单、高效、特异的优点,它主要通过核酸酶将双链RNA（dsRNA）切割成21-25nt的小干扰RNA,即siRNA,由siRNA按碱基配对的原则特异性的识别并切割同源性靶mRNA分子而实现。短发夹样RNA（short hairpin RNA,shRNA）在细胞内会自动被加工成siRNA,使基因沉默,且比siRNA作用更稳定,高效。本研究构建针对Survivin基因的特异性shRNA表达载体,探索针对Survivin基因的RNA干扰技术对大肠癌细胞系生物学功能的影响,构建裸鼠人大肠癌动物模型,观察其在体内对肿瘤的作用。研究方法1、针对Survivin基因的一段靶序列:GGCTGGCTTCATCCACTGC（86-104）采用GeneChemTMsiRNA的设计工具,参照siRNA的设计原则,利用含绿色荧光蛋白的真核表达载体pGCsi-H1/Neo/GFP,构建真核表达质粒。两条寡核苷酸经退火、限制性内切酶Hind和BamH1双酶切、连接、转化、PCR鉴定阳性克隆、构建pGCH1/Survivin shRNA表达质粒,测序验证。2、培养大肠癌细胞系SW480（Survivin高表达）,用非脂质体法将真核表达质粒转染入SW480,并应用硫酸盐G418进行筛选阳性克隆,转染后以流式细胞仪、荧光显微镜、透射电镜、Western-blot方法检测肿瘤细胞的凋亡、转染和细胞周期及Survivin蛋白的表达情况。3、MTT法测定质粒转染后SW480细胞的增殖情况。4、Transwell小室法测定对细胞迁移能力的影响。5、将SW480细胞和转染pGCH1/Survivin shRNA的SW480细胞分别接种裸鼠皮下,建立裸鼠人大肠癌荷瘤模型,观察shRNA-Survivin对成瘤性的影响6、采用双盲法定期测量皮下肿瘤结节的二维值,计算每个肿瘤的体积和各组平均体积变化的差值,计算肿瘤抑制率。7、免疫组织化学法测定Survivin蛋白的表达情况。8、TUNEL法和透射电镜检测肿瘤细胞凋亡情况。9、显微镜下观察肝,肾,肺等组织变化并测定血常规,了解siRNA对裸鼠血液系统,肝,肾,肺等器官的影响。结果1、成功构建了重组质粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin,经测序显示重组质粒shRNA编码序列与我们设计的靶向Survivin的核苷酸序列完全一致。2、绿色荧光蛋白载体构建的真核表达质粒瞬时转染SW480细胞,G418筛选获得了稳定转染的细胞株。荧光显微镜观察转染效率达90%以上,流式细胞仪分析和透射电镜显示转染后的细胞出现了细胞周期的变化（G2/M期增高）和凋亡的出现（细胞核内的染色质聚集,核内呈团块状,可见凋亡小体）。Western-blot分析转染后的细胞Survivin蛋白的表达受到抑制,转染后48小时和稳定转染后Survivin蛋白的表达分别被下调了52.1%、73.6%、45.8%、41.7%,抑制的时间较长。3、MTT测定显示转染重组质粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin后细胞的增殖受到抑制。4、Transwell小室法分析细胞的迁移能力显示转染重组质粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin后的SW480细胞迁移能力较未转染和转染阴性质粒的SW480细胞明显下降,抑制率为44.08%。5、接种转染细胞的裸鼠成瘤能力较未转染的裸鼠成瘤能力降低,成瘤时间延长,瘤结节的体积小,抑瘤率为67.86%。6、免疫组化测定转染质粒的裸鼠移植瘤Survivin的表达降低,TUNEL法和透射电镜显示凋亡增加,凋亡指数（17.25±3.30）%vs（5.48±1.38）%,（P＜0.05）。7、转染质粒的安全性分析显示,转染后的裸鼠与未转染组重要脏器的结构和功能以及血液系统都未受到影响。结论1、成功构建了重组质粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin。2、靶向Survivin的shRNA表达载体可以较长时间抑制Survivin蛋白的表达;抑制大肠癌细胞的增殖,诱导细胞的凋亡,改变了细胞周期。3、转染重组质粒后的SW480细胞迁移能力明显下降,说明Survivin除了抗凋亡和调节细胞周期的作用外,还可能参与和影响了肿瘤的转移过程,降低Survivin的表达还可能抑制肿瘤的转移。4、SW480细胞可成功在裸鼠身上建立大肠癌模型。5、事先转染特异的shRNA-Survivin的大肠癌SW480细胞成瘤性差,重组质粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin。能抑制大肠癌裸鼠移植瘤的发生和生长,诱导其凋亡。6、重组质粒没有明显毒副作用。