抑制素对山羊繁殖力的影响

论文摘要

抑制素（Inhibin,INH）是雄性动物睾丸支持细胞（Sertoli cells）和雌性动物卵巢颗粒细胞（Granulosa cells）分泌的二聚体糖蛋白激素。活化素（Activin, ACT）又名激活素,是最早在性腺中发现的一种糖蛋白激素。在结构上,INH基因由α亚基和β亚基（pA或pB）通过二硫键连接形成INHA （α-βA）和INHB （α-βB）两种形式,ACT由pA和pB亚基相互通过二硫键连接后形成ACTA （βA-βA）、ACTB （βB-βB）和ACTAB （βA-βB）三种形式。在雌性动物中,INH和ACT分别起到抑制和促进卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone, FSH）的合成和分泌的作用。本实验旨在研究抑制素在激素水平和基因水平上对不同繁殖力山羊品种（遗传资源）的影响情况,试图揭示抑制素对山羊繁殖力影响的遗传机制。1.山羊血浆中INHB、ACTA和FSH含量比较分析采用酶联免疫法（ELISA）测定并分析了大足黑山羊（n=5）、南江黄羊（n=5）和萨能奶山羊（n=4）3个山羊品种（遗传资源）在一个发情周期内FSH、INHB和ACTA三种激素的分泌变化规律,得到以下结果：（1）大足黑山羊发情周期为（20.1±0.5）d,南江黄羊的发情周期为（20.2±1.1）d,萨能奶山羊发情周期为（25.1±0.8）d。（2）在整个发情周期中,3个山羊品种（遗传资源）FSH分泌曲线中高峰点出现的时间和INHB分泌曲线中较低点出现的时间基本一致,FSH与INHB在3个羊种中都呈现极显著负相关（P<0.01）。3个山羊品种（遗传资源）的ACTA分泌变化趋势与FSH分泌变化趋势也比较一致,ACTA与FSH相关系数为正值,但均未达到差异显著水平（P>0.05）（3）大足黑山羊FSH在发情周期中出现的第1个分泌高峰点的水平显著高于南江黄羊和萨能奶山羊（P<0.05）；而大足黑山羊INHB在发情周期中出现的第1个分泌较低点的水平显著低于萨能奶山羊和南江黄羊（P<0.05）2.山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因的克隆和序列分析以大足黑山羊（n=3）、南江黄羊（n=3）和萨能奶山羊（n=3）为研究对象,采用RT-PCR技术克隆出INHα、INHβA和INHβB亚基基因cDNA序列,并已获得两个NCBI登录号（INHα:HQ699620和INHβA:HQ699621）,与GenBank中其它物种的相同亚基相同区段的同源性均在95%以上。（1）山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因cDNA序列分别为1124 bp、1364bp和1499 bp; CDS区分别为1083 bp、1278 bp和1227 bp;CDS区分别编码360、425和408个氨基酸,分别包含18、21和20个氨基酸信号肽,341、404和380个氨基酸成熟肽。CDS区编码的氨基酸与GenBank中其它物种相同亚基的相同区段编码的氨基酸同源性达96%以上。（2） INHα、INHβA和INHβB多肽相对分子质量分别为94.655 KD、109.132KD和100.438 KD,等电点（pI）分别为4.95、4.92和4.94,疏水性最小值分别为-0.467、-0.633和-0.567,最大值分别为2.344、2.422和2.267。均无蛋白跨膜区；蛋白的二级结构中,α螺旋分别占17.22%、21.65%和23.04%,β转角分别占5.28%、3.53%和4.41%,延伸链分别占18.89%、19.53%和18.14%,无规卷曲分别占58.61%、55.29%和54.41%。INHβA和INHβB多肽的三级结构均与人的INHβA多肽有116个氨基酸残基相匹配。（3）所测山羊INHα亚基基因cDNA序列与GenBank中绵羊（Ovis aries）外显子2比较,共发现19个变异位点,其中转换17个,颠换2个,氨基酸变异位点为8个；与NCBI上公布的波尔山羊（Capra hircus）外显子1和2部分序列相比,共发现3个变异位点,其中转换2个,颠换1个,氨基酸变异位点为2个,分别为第338位（外显子2第32位）C→G的突变导致氨基酸L→V,第345位（外显子2第39位）A→G的突变导致氮基酸Q→R。（4）所测山羊INHβA亚基基因cDNA序列与GenBank中绵羊相同区段相比,发现有10个碱基变异位点,均为转换,无颠换、插入或后缺失,其中CDS区第198位（cDNA）序列的第211位)A→G的突变导致氨基酸R→K。（5）所测山羊INHβB亚基基因cDNA序列与GenBank中绵羊序列相比,出现了12个变异位点,其中有5个转换,6个颠换,1个插入。引起氨基酸变异的位点有3个,860位G→T的变异导致氨基酸R→L,第871位插入碱基G使得氨基酸序列增加了一个G,第1372位G→T的突变使得氨基酸G→V。在大足黑山羊中却没有发现这3个位点的突变。3.山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因的外显子遗传多态性分析采用序列测定和PCR-SSCP技术,在大足黑山羊（n=28）和南江黄羊（n=27）中分析INHα、INHβA和INHβB亚基基因的外显子遗传多态性,结果发现：（1） INHα亚基基因外显子1内没有多态性位点,外显子2内都存在第32位（cDNA序列第338位）C→G和第39位（cDNA序列第345位）A→G的突变；INHβA亚基基因外显子部分序列中没有发现多态性位点；INHβB亚基基因两个外显子中没有发现多态性位点。（2）在更大群体中测序发现山羊INHa亚基基因的外显子2的第57位（cDNA序列第363位）存在G→A的突变,并引起了氨基酸R→H。（3） INHa亚基基因的外显子2 PCR-SSCP分析发现,在大足黑山羊和南江黄羊中出现了三种基因型（AA、AB和BB型）,大足黑山羊AA、AB和BB基因型频率分别为0.071、0.429和0.500,而南江黄羊分别为0.391、0.435和0.174；大足黑山羊B等位基因频率（0.714）高于A等位基因频率（0.286）,南江黄羊A等位基因频率（0.630）高于B等位基因频率（0.370）；经χ2检验发现,大足黑山羊和南江黄羊都处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。（4） INHa亚基基因的外显子2的多态性与产羔数的最小二乘分析发现,就前三胎产羔数、前二胎产羔数、前一胎产羔数和平均产羔数,大足黑山羊的BB型个体分别比AB型个体多0.595、1.01、0.703和0.769只（P<0.05）；南江黄羊BB型个体比AB型个体产羔数分别多了0.787、1.375和0.754只（P<0.05）,比AA型个体的产羔数分别多了0.849、1.486和1.131只（P<0.05）,但AA与AB型个体之间的差异未达到显著水平（P>0.05）；南江黄羊BB和AB型个体的前一胎产羔数分别比AA型个体多1.01和0.983只（P<0.05）,但AB型与BB型个体之间的差异未达到显著水平（P>0.05）4.山羊INHa, INHβA和INHβB亚基基因定量表达分析以大足黑山羊（n=7）、南江黄羊（n=7）和萨能奶山羊（n=7）为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术测定了山羊INHa, INHβA和INHβB亚基基因定量表达情况,结果发现：（1） INHa、INHβA和INHβB亚基基因在山羊的垂体、卵巢、心脏、肝、脾脏、肺和肾脏7种组织均有表达,卵巢组织表达水平高于垂体（P<0.05）；在卵巢和垂体组织中,3个山羊品种（遗传资源）中均表现出INHa表达水平最高、INHβA居中、INHPB表达水平最低。（2）在3个山羊品种（遗传资源）中,大足黑山羊的INHa、INHPA和INHβB亚基基因表达水平的各个组织中最低,萨能山羊居中,南江黄羊最高（P<0.05）。（3）相关性分析发现,卵巢组织INHa、INHβA和INHβB亚基基因表达水平与山羊采样时前一胎的产羔数呈负相关（P<0.10）。5.结论综上所述,得到如下结论：（1）在一个发情周期中,3个山羊品种（遗传资源）FSH水平与1NHB水平呈负相关,FSH水平与ACTA水平呈正相关,激素变化趋势与山羊卵泡发育波的出现基本吻合。（2）在一个发情周期中,伴随着最后一个卵泡发育波出现的较大量FSH分泌和较低水平的INHB分泌以及抑制素基因较低的表达水平可能与山羊的高繁殖力相关。（3）在山羊INHa亚基基因外显子1、INHβA亚基基因外显子部分序列和INHβB亚基基因两个外显子中没有发现多态性位点,这些亚基基因外显子序列对山羊的产羔数影响可能较小。（4）山羊INHa外显子2的第57位存在G→A的突变,并引起了氨基酸R→H,在不同个体中出现了三种基因型（AA、AB和BB型）。INHa外显子2的B等位基因可能是山羊高繁殖力的一个优势基因,INHa外显子2有可能作为山羊多胎性标记辅助选择的候选基因片段。（5） INHa、INHβA和INHβB三个亚基基因在山羊卵巢组织表达水平高于垂体。在山羊卵巢和垂体组织中,INHa亚基基因表达水平最高、INHβA居中、INHβB表达水平最低。

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中文摘要

ABSTRACT

英文缩略词一览表

第一章文献综述

1 抑制素

1.1 抑制素来源

1.2 抑制素基因的分子结构

1.3 抑制素分泌与表达

1.4 抑制素作用机理

1.5 抑制素基因的克隆和定位

1.6 抑制素基因的多态性及其与绵、山羊繁殖力相关性研究

1.7 抑制素免疫

1.8 抑制素受体

2 活化素

2.1 活化素的来源及结构

2.2 活化素对生殖的作用

2.3 活化素受体

2.4 活化素在动物繁殖中的应用

3 抑制素和活化素的关系

4 PCR-SSCP技术

5 实时荧光定量PCR

5.1 实时荧光定量PCR概述

5.2 实时荧光定量PCR方法

5.3 实时荧光定量PCR引物和探针设计要求

5.4 实时荧光定量PCR在畜牧领域的应用

6 实验羊只概况

6.1 南江黄羊

6.2 大足黑山羊

6.3 萨能奶山羊

第二章引言

第三章山羊血浆中INHB、ACTA和FSH含量比较分析

1 实验材料

1.1 实验羊只的选择与管理

1.2 实验羊只的处理和样本的采集

1.3 主要试剂、耗材和仪器设备

2 实验方法

2.1 血浆中FSH、INHB和ACTA水平的测定

2.2 统计分析方法

3 实验结果

3.1 大足黑山羊FSH、ACTA和INHB分泌变化分析

3.2 南江黄羊FSH、ACTA和INHB分泌变化分析

3.3 萨能奶山羊FSH、ACTA和INHB分泌变化分析

3.4 FSH、ACTA和INHB在3个山羊品种（遗传资源）中的比较分析

4 讨论

4.1 3个山羊品种（遗传资源）发情周期

4.2 3个山羊品种（遗传资源）的卵泡期及分泌峰值

4.3 3个羊种FSH、ACTA和INHB分泌特点分析

5 小结

第四章山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因的克隆及序列分析

1 实验材料

1.1 实验羊只的来源与样本采集

1.2 主要试剂和实验耗材

1.3 主要仪器设备

1.4 主要试剂配制

2 实验方法

2.1 总RNA提取及检测

2.2 引物设计

2.3 cDNA第一链的合成

2.4 cDNA序列的PCR扩增

2.5 PCR产物的回收和纯化

2.6 克隆

2.7 测序

2.8 序列分析

3 实验结果

3.1 卵巢组织总RNA的提取

3.2 INHα、INHβA和INHβB亚基基因PCR扩增结果

3.3 山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因cDNA序列分析

4 讨论

4.1 山羊组织中的总RNA的提取

4.2 山羊INHα、INHβA和INHβB序列结构

4.3 山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因序列多态性

5 小结

第五章山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因多态性分析

1 实验材料

1.1 实验羊只来源及样本采集

1.2 主要试剂及耗材

1.3 主要仪器设备

1.4 主要试剂配制

2 实验方法

2.1 基因组DNA的提取

2.2 DNA浓度和纯度的检测

2.3 引物的设计和合成

2.4 PCR反应条件和反应体系

2.5 PCR产物的回收纯化

2.6 克隆

2.7 序列测定

2.8 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.9 统计分析

3 实验结果

3.1 基因组DNA提取结果

3.2 PCR扩增结果

3.3 INHα外显子1多态性分析

3.4 INHα外显子2多态性分析

3.5 INHβA外显子部分序列多态性分析

3.6 INHβB外显子1和外显子2多态性分析

4 讨论

4.1 PCR反应条件和反应体系的优化

4.2 PCR-SSCP检测

4.3 INHα外显子1的多态性

4.4 INHα外显子2的多态性

4.5 INHβA外显子部分序列的多态性

4.6 INHβB外显子1和外显子2的多态性

5 小结

第六章山羊INHα、INHβA和INHβB亚基基因的定量表达

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 实验结果

2.1 INHα亚基基因在组织中的表达

2.2 INHβA亚基基因在组织中的表达

2.3 INHβB亚基基因在组织中的表达

3 讨论

3.1 不同羊种INHα、INHβA和INHβB亚基基因表达差异分析

3.2 不同组织INHα、INHβA和INHβB亚基基因表达差异分析

4 小结

第七章结论

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的论文、参加课题及获奖

抑制素对山羊繁殖力的影响

论文摘要

论文目录

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