论文摘要
目的：用三种不同的方法提取B群脑膜炎奈瑟氏菌的外膜囊泡,分别为dOMV、nOMV、sOMV,并比较分析其免疫原性和毒性,为B群脑膜炎OMV疫苗的研究提供了一定的实验依据。方法：用超速离心的方法获得三种OMV,通过SDS-PAGE实验分析其主要蛋白组分,Lowry法测定各种OMV的蛋白含量,LAL实验测定其内毒素含量。免疫小鼠,通过ELISA实验测定小鼠血清中的IgG含量,证实其免疫原性,杀菌力实验测试三种OMV诱导针对B群脑膜炎奈瑟氏菌补体依赖的杀菌反应。结果：SDS-PAGE实验结果显示三种外膜的主要蛋白成分基本一致。LAL实验证实sOMV的内毒素含量最多,其次为nOMV, dOMV含量最少。免疫小鼠后,ELISA和杀菌力实验证实nOMV的免疫效果最好,其次为dOMV, sOMV免疫效果较差。结论：用三种不同的方法成功制备了B群脑膜炎奈瑟氏菌的外膜囊泡（dOMV、nOMV、sOMV）,从免疫原性、毒性等方面对三种外膜囊做了评价和比较,为制备B群脑膜炎OMV疫苗的相关研究做了铺垫。脑膜炎球菌天然外膜微泡（nOMV）包含完整的外膜,其中的外膜蛋白（OMP）和脂寡糖（LOS）处于自然构象和天然外膜环境,有很好的免疫原性,但是其LOS毒性限制其应用。基因1pxL2编码与LOS脂质A合成相关的酶,1pxL2基因敲除后可以降低LOS毒性,并且可能会提高疫苗对表面活性剂的敏感度。在本研究中,应用基因敲除技术的方法和原理,通过PCR扩增B群脑膜炎球菌1pxL2基因及载体pGBK T7上的Kan抗性片段,1pxL2片段与puc-18载体连接得到重组质粒msb-puc,以重组质粒msb-puc为基础,分别通过反向PCR和酶切两种方法构建1pxL2基因中间片段的缺失,并在缺失位点连入Kan抗性表达盒,从而得到重组质粒mpK（impK）, mpK（impK）转化B群脑膜炎球菌,并用PCR的方法对转化子进行初步筛选鉴定,初步确定突变株一株。本研究通过基因敲除MenB中LOS合成途径相关基因1pxL2的方法,降低LOS毒性,为B群脑膜炎球菌OMV疫苗的研发做了铺垫。