金雀异黄素抗结肠癌作用及其机制的体内外实验研究

论文摘要

目的:通过体内外实验研究金雀异黄素（Genistein, Gen）对结肠癌细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响,探讨Gen抗结肠癌的作用机制,为寻求结肠癌治疗新的药物提供理论依据。方法:1体外实验:体外培养人结肠癌细胞SW480,采用四甲基偶氮唑蓝（tetrzolium-based colorimetric assay, MTT）比色法测定Gen对该细胞的增殖抑制作用,选择合适的实验剂量;采用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率;普通光学显微镜及透射电镜观察细胞形态学改变;采用流式细胞术（flow cytometry,FCM）半定量检测Gen诱导人结肠癌细胞凋亡过程中相关蛋白PCNA、P21、VEGF的表达情况。2体内实验:取健康雄性BALB/c小鼠（60只）称重,采用随机数字法将小鼠随机分为5组（每组12只）:对照组（生理盐水）;Gen低剂量组（1mg/kg）;Gen中剂量组（10mg/kg）;Gen高剂量组（20mg/kg）;5-氟尿嘧啶组（5-Fu）。将colon26细胞皮下接种于各组小鼠,建立荷瘤小鼠模型。当各组小鼠可触及到瘤体时开始给药,采用腹腔注射给药方式:对照组给予含二甲基亚砜（DMSO）的生理盐水0.2m（lDMSO<1%）;治疗组给予不同剂量的Gen,每日给药一次,连续给药14天;5-Fu组给予5-Fu 0.2ml（16.5 mg/ml）,每周腹腔注射一次,共两次。在此期间观察小鼠一般情况并记录体重和肿瘤大小。给药后第十五天将所有小鼠称重后处死,立即剥瘤、称重。计算肿瘤体积和抑瘤率。应用流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率。应用免疫组化法检测移植瘤组织PCNA、P21、VEGF蛋白的表达情况。结果1体外实验结果1.1 Gen对SW480细胞增殖的影响:MTT检测结果显示10、20、40、80μg/ml Gen对SW480细胞增殖具有抑制作用。不同浓度Gen处理细胞2472h后,各实验组OD值均有不同程度下降,与对照组相比,有显著性差异（P<0.01）。随着Gen浓度的增加、作用时间的延长,OD值逐渐下降。Gen对SW480细胞的增殖抑制作用呈明显的剂量-效应关系和时间-效应关系。抑制率以80μg/ml Gen作用72h为最高,可达60.2%。1.2流式细胞仪检测结果显示: 0、20、40、80μg/ml Gen作用SW480细胞48h后,随药物浓度增加,G2/M期细胞逐渐增多,G0/G1期细胞逐渐减少。提示Gen可阻滞SW480细胞周期于G2/M期,该作用有剂量依赖性。0、20、40、80μg/ml Gen作用细胞48h后,凋亡百分率分别为:1.40%、8.01%、24.22%、47.01%。流式细胞仪可测得典型的亚二倍体凋亡峰,凋亡率随Gen浓度增加而逐渐升高。各处理组的凋亡率与对照组相比,有显著性差异（P<0.01）。1.3光镜下观察细胞形态变化结果显示:未经药物作用的细胞形态多样,有圆形、梭形及多边形,形态饱满,药物作用后细胞皱缩,破裂,有的细胞两端出现细长的伪足,细胞胞浆中出现空泡,脱落细胞增多。1.4透射电镜下观察细胞超微结构发生改变:细胞体积缩小,微绒毛数量减少,核膜皱缩,核染色质高度浓缩,电子密度增高,边集于核膜下,形成沿核膜收缩的新月状小体。1.5流式细胞仪半定量检测SW480细胞中PCNA、P21、VEGF蛋白表达结果显示:0、20、40、80μg/ml Gen作用SW480细胞48h后,PCNA、VEGF蛋白的荧光指数FI值均随处理浓度增大而逐渐降低。P21蛋白的荧光指数FI值随处理浓度增大而逐渐增大。对于每一种蛋白,比较其处理组和空白对照组的FI值,均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。2体内实验结果2.1 Gen明显抑制小鼠肿瘤的生长,各组小鼠处死后肿瘤体积的比较,Gen低、中、高剂量组和5-Fu组肿瘤体积明显低于对照组,有显著性差异（P<0.01）,且实验组的肿瘤体积随Gen剂量的增大而减小。Gen低、中、高剂量组和5-Fu组的抑瘤率分别为:11.7%、28.8%、40.8%、62.0%,三个用药组的抑瘤率随Gen剂量的增大而增加。2.2流式细胞术检测结果显示:Gen低、中、高剂量组与对照组相比,G2/M期细胞逐渐增多,G0/G1期细胞逐渐减少。提示Gen可阻滞细胞周期于G2/M期,该作用有剂量依赖性。对照组、Gen低、中、高剂量组和5-Fu组的凋亡百分率分别为:3.16%、10.26%、19.35%、27.27%,49.64%。不同剂量Gen组和5-Fu组均测得典型的亚二倍体凋亡峰,凋亡率随Gen剂量的增加而逐渐升高。Gen各剂量组、5-Fu组的凋亡率与对照组相比,均有显著性差异（P<0.01）。2.3免疫组化检测结果显示:PCNA、P21蛋白表达于细胞核,VEGF蛋白表达于细胞浆和血管内皮细胞,可见棕黄色着色。按照IHS值法进行免疫组化评分。PCNA、VEGF蛋白表达值（IHS值）随Gen剂量的增大而逐渐减小,P21蛋白表达值（IHS值）则随药物剂量的增大而逐渐增加。对于每种蛋白,比较其处理组和对照组的IHS值,均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。结论1 Gen在一定剂量范围内能抑制结肠癌细胞增殖,并呈剂量依赖性。2 Gen抑制结肠癌细胞生长与诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期于G2/M期有关,该作用呈一定的剂量依赖性。3 Gen抗结肠癌作用机制可能与下调PCNA、VEGF蛋白,上调P21蛋白的表达有关。4 Gen具有抑制结肠癌细胞增殖及诱导其凋亡的作用,为结肠癌治疗及化学预防提供了新的思路和理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 金雀异黄素抗结肠癌作用及其机制的体内外实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 金雀异黄素抗肿瘤作用的研究进展
• 致谢
• 个人简历