鸡TLR4和Mx基因遗传变异及其表达规律分析

论文摘要

在现代畜牧业生产中疾病尤其是传染性疾病严重影响着畜禽的健康,影响生产性能和产品质量,造成巨大经济损失。从长远来看,通过开展抗病育种从遗传素质上提高对病原的抗性,并结合免疫接种控制畜禽的疾病是一种高效可行的方法。针对某一特定疾病,分析抗性相关基因及其对疾病抗性的调控机制是开展抗病育种尤其是分子标记辅助选择的基础和关键。对鸡特殊抗病力和一般抗病力相关抗性基因的研究已渐成热点,目前急切需要进一步开展相关抗性基因的遗传效应和调控机制分析。研究表明,TLR4（Toll-like receptor4）和Mx（myxo-virus resistance）基因是目前备受关注的2个抗病基因,TLR4基因与动物对疾病的抗性／易感性密切相关,Mx蛋白基因（myxo-virus resistance gene）是到目前为止唯一得到功能验证的抗禽流感病毒基因。本研究采用PCR-SSCP和错配PCR-RFLP与DNA测序相结合,分别研究这2个重要的抗性相关基因在15个鸡群体中的遗传变异,同时采用实时荧光定量PCR法研究了2个基因在4周龄如皋鸡16个组织（大肠、大脑、肺、法氏囊、肝、喉头、脾、气管、肾、腿肌、胸腺、小肠、心、胸肌、小脑和腺胃）中的表达差异以及在如皋鸡5个不同组织（肺、法氏囊、胸腺、气管和脾）中不同发育时期（2w、4w、6w、8w、10w和12w）的表达规律；本试验还同时分析α-干扰素在如皋鸡不同发育阶段的变化规律,旨在进一步阐明TLR4和Mx基因的功能和遗传效应,分析利用TLR4和Mx基因进行分子选育的可行性,为鸡的抗病育种和遗传改良提供分子水平的参考依据。试验主要结果如下：1.采用PCR-SSCP方法对14个鸡品种和红色原鸡的TLR4基因外显子2的多态性进行了检测,共检测到2个等位基因,AA、AB和BB三种基因型,其中藏鸡和红色原鸡仅检测到BB基因型,其它鸡品种中均出现AA、BB和AB三种基因型；等位基因A的频率平均为0.4371,等位基因B的频率平均为0.5629。BB基因型频率最高,AB型次之,AA型最低,分别为0.3912、0.3727、0.2507。测序结果发现2个突变位点,分别为g.114G>A、g.142G>A；g.114G>A为沉默突变,没有引起氨基酸的改变,g.142G>A为错义突变,氨基酸由谷氨酸转变为赖氨酸。卡方适合性检验结果显示：除固始鸡显著偏离Hardy-Weinbery平衡（P<0.05）外,其余鸡种和红色原鸡均处于Hardy-Weinbery平衡状态（P>0.05）；红色原鸡和藏鸡群体无多态（PIC=0）,其余群体均处于中度多态（0.25<PIC<0.5）；基于等位基因频率构建的UPGMA聚类图,14个鸡品种和红色原鸡共分为4大类,聚类结果反映了中国地方鸡种在一般抗性上确实存在着差异。2.采用错配PCR-RFLP方法检测14个鸡品种和红色原鸡Mx基因2032位点的多态性。采用的限制性内切酶Rsa Ⅰ能准确检测出地方鸡种Mx基因抗性位点A/G间的突变,结果显示,Mx基因2032位点经RsaⅠ酶切后,检测到AA、AG和GG3种基因型,基因型频率分别为0.191、0.399和0.410,抗性等位基因A的频率为0.391。卡方适合性检验结果显示：除文昌鸡、安卡鸡和仙居鸡3个鸡品种在Nx基因2032位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P<0.05）外,其余鸡品种和红色原鸡均处于Hardy-Weinbery平衡状态（P>0.05）；文昌、安卡、固始、乌骨、仙居、萧山、皖南三黄鸡和藏鸡呈中度多态性；茶花、河南斗鸡、鹿苑、大骨、油鸡、淮南麻黄鸡和藏鸡呈低度多态性；基于等位基因频率构建的UPGMA聚类图,14个鸡品种和红色原鸡共分为3大类群,聚类结果反映了15个群体在Mx基因2032位点抗性方面存在的遗传差异。3.实时荧光定量PCR法检测结果表明：TLR4基因在如皋鸡16个组织（大肠、大脑、肺、法氏囊、肝、喉头、脾、气管、肾、腿肌、胸腺、小肠、心、胸肌、小脑和腺胃）中广泛表达,在肺、胸肌、心、肝和腿肌中表达量相对较高；在脾、法氏囊、气管、肾、大脑和小脑中次之；胸腺、喉头、腺胃、大肠和小肠中表达量较低。其中在肺中的表达量最高,腺胃中的表达量最低。选取免疫应答相关的胸腺、脾、肺、法氏囊和气管等5个组织来进一步研究,在如皋鸡不同性别的个体之间,TLR4基因在法氏囊中不同发育时期的表达趋势相似,在胸腺和脾脏中的表达趋势在2、4、6周龄时相似,在6周龄以后出现较大的差异；而在肺和气管中不同发育时期的表达趋势存在较大的差异。不同组织之间的比较表明,TLR4基因在如皋母鸡肺、法氏囊、胸腺、气管和脾中不同时期表达量均无显著差异；在公鸡中,肺、法氏囊和气管中的部分时期表达量存在显著差异（P<0.05）。Mx基因在如皋鸡16个组织（大肠、大脑、肺、法氏囊、肝、喉头、脾、气管、肾、腿肌、胸腺、小肠、心、胸肌、小脑和腺胃）中同样广泛表达,在气管和小肠中的表达量相对较高；在胸腺、肺、肝、肾和法氏囊中次之；心、脾、喉头、大脑、小脑、腿肌、胸肌、大肠和腺胃中表达量较低。其中在脾脏中的表达量最低。在如皋鸡不同性别的个体之间,Mx基因在肺和胸腺中不同发育时期的表达趋势基本相似,而在脾脏、法氏囊和气管中不同发育时期的表达趋势存在较大的差异。总体而言,Mx基因在母鸡胸腺、脾、肺、法氏囊和气管5个免疫相关的组织中表达量开始处于较低的水平,随后逐渐上升；而在公鸡这5个组织中的表达一开始就处在较高的水平,表达量处于波动状态。除10周龄以外,Mx基因在公鸡各免疫器官中不同时期的表达量均高于母鸡,说明Mx基因的表达可能存在一定的性别差异,并且在不同性别中生物学效应可能也存在一定的差异。4.本研究使用鸡α干扰素（Interferon-α, IFN-α）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒对0、4、6、8、10和12周龄6个阶段的如皋鸡的α干扰素浓度进行了测定,结果显示,如皋鸡IFN-α浓度在6周龄时最低,8周龄时达到最高,随后开始下降,10周龄到12周龄基本维持在同一水平。在各相邻阶段,0-4周龄、4-6周龄、6-8周龄和8-10周龄之间分别呈极显著差异（P<0.01）,仅10-12周龄之间无显著差异。在注射活苗之后,IFN-α浓度会显著上升。采用两种方法估计出如皋鸡IFN-α水平的正常值范围为（3.34-4.92）。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 TLRs家族及其研究进展
• 1.1 TLRs家族概述及其研究进展
• 1.2 TLR4概述及其研究进展
• 2 Mx基因概述及其研究进展
• 3 干扰素概述及其研究进展
• 3.1 干扰素作用机制
• 3.2 干扰素分类及功能
• 3.3 干扰素研究进展
• 4 荧光定量PCR技术
• 5 本研究的目的和意义
• 第二章 鸡TLR4基因遗传变异分析
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 DNA提取
• 2.2 引物设计
• 2.3 PCR扩增
• 2.4 电泳判型
• 2.5 序列测定
• 2.6 统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 引物的扩增效果检测
• 3.2 TLR4基因PCR-SSCP检测结果
• 3.3 TLR4序列分析结果
• 3.4 不同鸡种TLR4基因外显子2的基因型及其等位基因频率分析
• 3.5 TLR4基因群体遗传变异分析
• 3.6 基于TLR4基因等位基因频率的聚类分析
• 4 讨论
• 4.1 鸡TLR4单核苷酸多态性
• 4.2 鸡TLR4基因遗传变异分析
• 4.3 鸡TLR4基因聚类分析
• 第三章 鸡Mx基因遗传变异分析
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 2 试验方法
• 2.1 DNA提取
• 2.2 引物设计和限制性内切酶的选择
• 2.3 PCR-RFLP
• 2.4 电泳分型
• 2.5 序列测定
• 2.6 统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 PCR扩增效果检测
• 3.2 Mx基因PCR-RFLP检测结果
• 3.3 Mx序列分析结果
• 3.4 不同鸡种Mx基因的2032位点的基因型及其等位基因频率分析
• 3.5 Mx基因群体遗传变异分析
• 3.6 基于Mx基因等位基因频率的聚类分析
• 4 讨论
• 4.1 Mx基因抗性位点检测和等位基因频率分布
• 4.2 Mx基因群体遗传变异分析
• 4.3 基于Mx基因等位基因频率的聚类分析
• 第四章 TLR4基因、Mx基因不同发育阶段表达规律的分析
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 鸡组织总RNA的提取
• 2.2 引物设计与合成
• 2.3 RT-PCR扩增
• 2.4 目的片段的回收和克隆测序
• 2.5 实时荧光定量PCR
• 2.6 数据处理与统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA的纯度与完整性
• 3.2 荧光定量PCR引物常规PCR检测及测序结果
• 3.3 荧光定量PCR的熔解曲线
• 3.4 TLR4基因在如皋鸡中不同发育阶段不同组织中的表达规律
• 3.5 Mx基因在如皋鸡中不同发育阶段不同组织中的表达规律
• 4 讨论
• 4.1 TLR4基因的表达
• 4.2 Mx基因的表达
• 第五章 如皋鸡α干扰素不同时期变化规律分析
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂
• 2 试验方法
• 2.1 实验原理
• 2.2 实验操作步骤
• 2.3 操作程序总结
• 2.4 数据计算及分析
• 3 结果与分析
• 3.1 鸡IFN-α不同时期浓度变化规律
• 3.2 免疫对鸡IFN-α浓度的影响
• 3.3 如皋鸡IFN-α正常值范围的估计
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表和参与发表的学术论文目录