抗真菌病基因转化苹果和番茄的研究

论文摘要

抗真菌病害的改良是苹果和番茄育种的目标之一,利用基因工程技术将外源抗真菌病基因导入苹果和番茄中,一旦证实其对病原真菌具有抗性,可作为抗病育种的材料或者抗病品种加以应用。本研究以‘嘎拉’苹果无菌组培苗和‘中蔬四号’番茄无菌组培苗为材料,利用根癌农杆菌介导法,进行了抗病基因PGIP及几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶二价基因的遗传转化。主要研究结果如下:构建了富士苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的植物表达载体pWR306-PGIP,导入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化苹果和番茄,获得了5个PCR鉴定为阳性的苹果抗性芽;8株PCR鉴定为阳性的番茄植株;利用根癌农杆菌介导法将几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶二价基因转入苹果和番茄中,经过PCR鉴定后初步确定4个苹果抗性芽为阳性植株;9株番茄抗性植株为阳性植株。对转基因植株中的目标酶活进行测定,首先进行了酶活测定条件的优化,试验结果表明:几丁质酶反应的最适温度和最适pH值分别为40℃和5.0;最适的反应时间和显色时间分别为60 min和15 min;β-1,3-葡聚糖酶反应的最适温度为50℃;最适pH值为4.5和8.5两个;最适的反应时间和显色时间分别为30 min和20 min。然后测定了目的基因编码的酶活性,试验结果表明转基因植株几丁质酶活性和β-1,3-葡聚糖酶活性比对照植株酶活性均有提高,提高的幅度在7.27%127.27%和37.63%279.64%之间。对转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶二价基因阳性番茄植株进行离体抑菌试验,转基因植株几丁质酶粗酶液对苹果斑点病和葡萄炭疽病抑菌率比对照分别提高50%和49.8%,转基因植株β-1,3-葡聚糖酶粗酶液对苹果斑点病和葡萄炭疽病抑菌率比对照分别提高50%和33.3%,转基因植株几丁质酶粗酶液和β-1,3-葡聚糖酶粗酶液的混合液对苹果斑点病和葡萄炭疽病的抑菌率比对照均提高66.6%。对转PGIP基因PCR鉴定为阳性的番茄植株进行病原菌PG酶活抑制试验,转基因植株PGIP粗蛋白液对日本曲霉PG酶的抑制率比对照提高45%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1.1 PGIP、CHI 和GLU 的研究进展
• 1.1.1 PGIP 的研究
• 1.1.2 CHI 基因在植物抗真菌性病害基因工程中的应用
• 1.1.3 GLU 基因在植物抗真菌性病害基因工程中的应用
• 1.1.4 CHI 和GLU 在植物抗真菌性病害基因工程中的协同作用
• 1.2 苹果转基因改良的研究进展
• 1.2.1 苹果转基因改良取得的研究成果
• 1.2.2 农杆菌介导的苹果遗传转化的研究
• 1.2.3 苹果遗传转化中存在的问题及展望
• 1.3 番茄遗传转化的研究进展
• 1.3.1 番茄离体培养研究进展
• 1.3.2 农杆菌介导的番茄遗传转化的研究
• 1.3.3 番茄遗传转化中存在的问题
• 1.3.4 番茄遗传转化研究的前景与展望
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二部分 试验研究
• 2.1 试验材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 PGIP 基因植物表达载体的构建
• 2.2.2 苹果叶片卡那霉素抗性筛选浓度的确定
• 2.2.3 转基因苹果抗性芽和番茄抗性植株的获得和PCR 鉴定
• 2.2.4 转CHI 和GLU 双价基因番茄植株CHI 酶活性测定条件优化
• 2.2.5 转CHI 和GLU 双价基因的番茄植株CHI 酶活性检测
• 2.2.6 转CHI 和GLU 双价基因番茄植株GLU 酶活性测定条件优化
• 2.2.7 转CHI 和GLU 双价基因的番茄植株GLU 酶活性检测
• 2.2.8 转基因番茄的抗病性鉴定
• 第三部分 讨论
• 3.1 转基因植株抗生素抗性筛选假阳性的原因
• 3.2 苹果PGIP 基因的抑菌作用
• 3.3 不同转基因株系抗病性差异的原因
• 3.4 CHI 和GLU 抗病协同作用
• 3.5 CHI 和GLU 酶活性测定条件的优化
• 第四部分 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介