ERAF17基因在黄瓜雌花分化中的作用

论文摘要

ERAF17基因是通过基因RNA表达谱的差显技术得到的黄瓜中,控制植物花器发育的MADS-box基因家族的一个基因。ERAF17基因在黄瓜的雌雄生殖器官的表达不同,可以由乙烯（或者能释放乙烯的物质）诱导表达,从而推动雌性化,但是它的作用机制却不清楚,并没有明确的证据表明ERAF17基因与雌花的发育有直接关系,所以本论文研究重点在于证明乙烯诱导ERAF17基因的表达对黄瓜雌花的分化有确定的正相关,从而可以探索黄瓜雌性器官发育存在的可能的信号通路,并对应用前景进行评估。本论文研究通过提取植物总RNA和RT-PCR克隆得到黄瓜ERAF17基因,利用PCR、限制性酶切、连接和农杆菌转化技术,得到转化了ERAF17基因和ERAF17基因沉默序列（发卡结构）的农杆菌EHA105,用于黄瓜的转化。通过农杆菌侵染、再生体系和卡那霉素作为筛选剂的筛选体系,得到了基因组中整合两种序列的转化苗,在DNA和RNA水平上进行了鉴定,并且发现转化的植株在表型上发生了相应的变化,正常的栽培种黄瓜植株在低节位生雄花,高节位生成雌花,而转化了发卡结构的植株发生了预期的沉默,所有节位上只生成雄花,没有生成雌花,而转化了ERAF17基因的植株也只生成雄花,没有生成雌花。从这些证据证明ERAF17基因的表达确实在黄瓜雌花的分化中起到了重要作用。另外采用原核表达的方法表达了ERAF17基因的融合蛋白,免疫小鼠得到多克隆抗体,用于转基因植物的检测。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1.1 植物性别决定机制
• 1.2 黄瓜性别决定机制的研究进展
• 1.2.1 黄瓜性别的发育
• 1.2.2 黄瓜性别决定基因
• 1.2.3 激素和环境对黄瓜性别的影响
• 1.2.4 乙烯的生理作用
• 1.2.5 乙烯对植物性别的作用
• 1.3 被子植物中MADS-box基因家族的结构和功能
• 1.3.1 MADS-box基因的结构
• 1.3.2 MADS-box的名称
• 1.3.3 植物花发育的ABC模型
• 1.4 黄瓜性别决定基因 ERAF17 的发现和分离
• 1.5 RNA沉默技术在植物基因功能研究上的应用
• 1.6 植物转化在植物基因功能研究上的应用
• 1.7 黄瓜转化技术
• 1.8 原核表达技术的发展和应用
• 材料与方法
• 2.1 ERAF17 基因cDNA全序列
• 2.2 转化用pMBW30 载体图谱
• 2.3 黄瓜品种
• 2.4 提取RNA钓取ERAF17 目的基因
• 2.4.1 RNA提取的处理
• 2.4.2 RNA提取步骤（trizol法）
• 2.4.3 RT-PCR反应体系
• 2.4.4 RT-PCR反应程序
• 2.5 过表达和沉默载体的构建
• 2.5.1 过表达载体的构建
• 2.5.2 发卡结构沉默载体的构建
• 2.6 黄瓜的组织培养和转化
• 2.6.1 农杆菌的准备
• 2.6.2 黄瓜的再生和转化过程
• 2.7 转基因植株的检测
• 2.7.1 表达植株DNA水平鉴定
• 2.7.2 转化植株的PCR检测
• 2.7.3 转化植株的RNA水平鉴定
• 2.8 原核表达和抗体制备
• 2.8.1 蛋白表达
• 2.8.2 免疫小鼠
• 2.8.3 ELISA
• 2.8.4 Wstern Blot 步骤
• 结果
• 3.1 ERAF17 的基因钓取和构建载体的鉴定
• 3.2 黄瓜转化过程和结果
• 3.3 转化植株在DNA水平上的鉴定
• 3.4 转化植株在RNA水平的鉴定
• 3.5 转化植株的表型变化
• 3.6 ERAF17 蛋白原核表达及多克隆抗体制备
• 讨论
• 4.1 黄瓜遗传转化过程分析
• 4.2 利用过表达策略分析ERAF17 基因的功能
• 4.3 利用基因沉默策略分析ERAF17 基因的功能
• 4.4 ERAF17 蛋白的原核表达和抗体制备
• 4.5 总结和展望
• 结论
• 参考文献
• 致谢