基于本草知识的酒蒸黄连“止消渴”系统研究

论文摘要

糖尿病已成为严重危害人类健康的重大疾病,积极防治尤为关键。黄连酒蒸炮制“止消渴”,历代本草多有记载,临床疗效确切。本课题在前期研究的基础上基于古代本草知识,从临床有效性出发,系统围绕黄连酒蒸炮制前后的药效差异及其作用机制、降低”苦寒”毒副作用、入血成分变化、药效物质基础以及相关酒蒸炮制机理,多方面、多层次、多学科交叉结合开展酒蒸黄连“止消渴”的系统研究,从“入血成分变化——药效发挥——药效物质基础——体内物质变化——相关药效及炮制机理”,全方位阐述中药黄连酒蒸炮制机理和“止消渴”疗效的专属性,以期指导中医药糖尿病特色专科的临床用药。结果表明：（1）药效方面黄连酒蒸炮制后,无论是体内糖尿病动物疾病模型,还是体外3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型,均具有明显的改善糖脂代谢异常,改善胰岛素抵抗,保护胰岛B细胞的药效作用。主要表现在以下几个方面：①改善糖代谢。酒蒸黄连能明显降低不同糖尿病动物模型的高Glu水平和GHb、GSP的含量,有效改善OGTT和ITT的异常。在降低Glu的同时,还能有效减轻糖异生的异常,增加肝糖原的含量,提高机体对肝糖原的储备和利用,而对正常Glu和Ins的分泌无明显影响。②改善脂质代谢。酒蒸黄连能明显改善不同糖尿病动物模型体内血脂的异常,降低模型动物血清TC、TG、LDL-C和NEFA的含量,升高血清HDL-C的含量。体外细胞实验也显示,酒蒸黄连能明显抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化,减少体内脂肪聚集,减少糖尿病并发心血管疾病的风险。③改善胰岛素抵抗,保护胰岛B细胞。酒蒸黄连对不同糖尿病动物模型,能明显降低HOMA-IR胰岛素抵抗指数,增加胰岛素IAI敏感指数,改善胰岛B细胞HBCI、FBCI功能指数。胰腺病理也显示,酒蒸黄连能明显增加糖尿病大鼠胰腺组织胰岛的数量,改善胰岛及腺体的萎缩程度。同时,体外细胞实验也证实,酒蒸黄连能明显增强3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取和利用,体内、外共同改善胰岛素抵抗。④具有一定的a-葡萄糖苷酶抑制剂作用。酒蒸黄连还能明显抑制小鼠灌服蔗糖引起的Glu含量升高,作用与阿卡波糖相似,其作用可能与抑制淀粉类碳水化合物的吸收,降低餐后血糖有关。⑤纠正血乳酸的异常。酒蒸黄连的特色优势还在于,能明显降低不同糖尿病动物模型血清LD的异常。这对防止高乳酸血症引起的糖尿病酮症酸中毒,具有十分积极的意义。上述作用均优于黄连生品。（2）降低”苦寒”毒副作用方面黄连酒蒸炮制后,能明显降低生品黄连的”苦寒”毒副作用。主要表现为,炮制后急性毒性的降低,亚急性毒性血小板数量及功能的影响降低,肝、肾功能和胃肠功能的毒性降低。上述作用优于黄连生物碱混合品和黄连生品。（3）药效物质基础方面①基于糖尿病动物模型,建立酒蒸黄连动态血清指纹图谱,检测出血清中17个移行成分,包括药材原型成分9个、代谢产物8个,其中已确定药材原型成分中7个峰的归属,分别是木兰花碱、药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱。②通过对各时间点血清指纹图谱的动态分析发现,酒蒸黄连药材中,上述季铵型生物碱成分入血后均发生极性的改变。除部分原型吸收外,其余均转化为极性更大的代谢产物。同时,大部分生物碱成分入血后表现为双峰吸收,在给药后1.5 h和给药后3.0-6.0 h出现吸收高峰,提示药材成分除原型吸收外,还可能存在肠肝循环,或不同肠段部位的再吸收。③结合上述酒蒸黄连的入血成分分析,基于生物效应法,探索酒蒸黄连“止消渴”的药效物质基础。结果发现,无论是酒蒸黄连水提物、不同化学部位（生物碱、非生物及总多糖）,还是不同生物碱成分（小檗碱、巴马汀、黄连碱、药根碱、表小檗碱及非洲防己碱）,均能明显或部分抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化,增强3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型对葡萄糖的摄取和利用,改善胰岛素抵抗。其中单体成分盐酸黄连碱在浓度16.5μmol/L时,抑制分化作用最为明显；而成分盐酸药根碱在浓度10.5μmol/L时,提高葡萄糖相对利用率作用最为明显。上述作用提示,酒蒸黄连“止消渴”的药效物质基础是多成分、多部位的共同作用。酒蒸黄连能明显改善胰岛素抵抗活性,并能有效抑制前脂肪细胞的分化。该作用表明,酒蒸黄连在增加细胞对葡萄糖摄取的同时,不会引起脂肪的聚集而造成体重增加。这对于防治与胰岛素抵抗相关的代谢综合征及其并发症,具有一定的临床意义。（4）酒蒸炮制机理方面分别从黄连酒蒸炮制后药材的性状、显微变化、化学成分变化,以及药效成分入血后的体内药动学过程,多方面、逐层次的诠释酒蒸黄连“止消渴”的炮制机理。①药材性状、显微变化。黄连药材酒蒸炮制后色泽加深,质变酥脆；辅料黄酒略显弱酸性,并富含多种微量元素,能与黄连药材中部分游离型生物碱结合,促使其转换为结合型可溶性盐,且黄酒有助于药材中某些生物碱成分极性的改变,这些均有利于煎出率的增加。同时,显微特征的主要变化为鳞叶表皮细胞的少见和淀粉粒的糊化。淀粉粒的糊化有助于生物碱成分在胃肠道的吸收,提高机体生物利用度,增加疗效。②化学成分变化。黄连酒蒸炮制后,未见明显的物质成分变化,仅存在各生物碱成分炮制前后含量的略微差异,以非洲防己碱和表小檗碱成分较炮制前有明显差异,提示黄连酒蒸炮制的机理可能与各成分在体内的药动学过程及其生物利用更为相关。③生物碱成分体内药动学过程。建立血清中黄连5种小檗碱型生物碱浓度的测定方法,基于糖尿病动物模型,研究黄连炮制前后在大鼠体内的药动学过程变化,发现5种小檗碱型生物碱在体内均属于快速吸收、慢速消除类物质,双峰吸收；通过酒蒸炮制后,5种小檗碱型生物碱成分在体内的吸收均有不同程度的增加,尤以小檗碱和巴马汀在大鼠体内的生物利用度较炮制前明显增加,吸收能力增强,但不同性别大鼠体内药动学过程差异较大,雌性吸收高于雄性。此外,各成分在吸收增加的同时,Tmax、MRT及Vz均有不同程度的下降,提示这些成分的变化可能是酒蒸炮制增效减毒的物质基础。上述炮制变化表明,黄连酒蒸炮制的机理可能是通过炮制改变了药物有效成分的晶型、结构及其极性,提高药材的煎出率和有效成分的溶解,促进有效成分在胃肠道的吸收、分布,提高药物在机体的生物利用度,以此达到减毒增效的疗效专属性。（5）药效机制方面酒蒸黄连“止消渴”的药效作用机制通过以下几方面来实现：①改善糖脂代谢。无论是体内动物疾病模型,还是体外细胞模型,酒蒸黄连均能明显增加PPARa/β蛋白和mRNA的表达,显示出一定的PPARa/β双重激动剂作用。同时,升高体内ADP的含量,降低Resistin的含量,而对PPARy无明显影响。②减少氧化应激损伤。酒蒸黄连能明显降低体内MDA的含量,升高SOD和GSH的活性,抗脂质过氧化,增强体内清除自由基,提高机体抗氧化的能力。③减轻炎症反应。酒蒸黄连能明显减少体内TNF-a、NF-κB、IL-1β、PGE2、NO及NOS等炎性因子及炎性介质的释放,缓解相关炎症途径的反应,有效保护胰岛B细胞的结构及功能,改善IR。④缓解胰岛B细胞的凋亡和损伤。酒蒸黄连能明显抑制NF-κB的表达,增加胰岛Bcl-2蛋白的表达,降低Caspase-3蛋白的表达,抑制NF-κB/caspases-3相关信号通路。同时,对胰腺细胞的超微结构显示,酒蒸黄连还能明显增加胰腺细胞内分泌颗粒的数量,恢复细胞内线粒体、内质网和细胞核等细胞器的正常构架,有效缓解胰岛B细胞的凋亡和损伤。上述作用多途径、多靶点的改善胰岛素抵抗和保护胰岛B细胞的结构和功能,共同防治2型糖尿病及其并发症的发生。综上所述,酒蒸黄连“止消渴”的疗效专属性、药效物质基础及其作用机制、炮制机理已较为明确。酒蒸黄连对2型糖尿病及其并发症的发生,具有良好的防治作用。酒蒸黄连“止消渴”,本草记载历史悠久,炮制特色鲜明,增效减毒作用明确。为此,我们建议,在中医药治疗“消渴证”的临床组方配伍用药或新药开发研究中,较生品黄连更适宜于选用酒蒸黄连,使用时应考虑临床用药剂量的个体化。这也体现了中医“随症炮制”的临床用药特色,值得更进一步的研究、关注。

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中文摘要

Abstract

英文缩略词表

前言

1 糖尿病已成严重危害人类健康的重大疾病

1.1 2型糖尿病的流行病学

1.2 2型糖尿病的病因、病机

1.3 2型糖尿病的治疗状况

2 中医药治疗2型糖尿病疗效显著,独具特色

3 中药黄连"止消渴"用药历史悠久,临床疗效确切

3.1 黄连"止消渴"的本草考证

3.2 黄连治疗2型糖尿病的现代研究进展

3.3 黄连酒蒸炮制"止消渴",更体现了"随症炮制"的临床用药特色

4 前期工作基础

5 立题依据及选题意义

6 技术路线

实验研究

第一部分酒蒸黄连炮制前后"止消渴"的药效差异研究

第一节基于3T3-L1前脂肪细胞的酒蒸黄连炮制前后药效差异

1 实验材料

2 实验方法及结果

2.1 3T3-L1前脂肪细胞的正常培养及生长曲线的建立

2.2 3T3-L1前脂肪细胞的分化及脂肪细胞的鉴定

2.3 酒蒸黄连炮制前后对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响（MTT法）

2.4 酒蒸黄连炮制前后对3T3-L1前脂肪细胞诱导分化的影响（油红O法）

2.5 酒蒸黄连炮制前后对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗（IR）模型葡萄糖利用的影响

3 小结

第二节基于糖尿病动物模型的酒蒸黄连炮制前后药效差异

1 实验材料

2 实验方法及结果

2.1 对小鼠正常血糖的影响

2.2 对高浓度葡萄糖致小鼠急性血糖升高的影响

2.3 对正常小鼠a-葡萄糖苷酶的抑制作用

2.4 对四氧嘧啶致糖尿病小鼠的影响

2.5 对STZ复合高脂高糖致2型糖尿病大鼠的影响

3 小结

第二部分酒蒸黄连降低"苦寒"毒副作用实验研究

1 实验材料

2 实验方法及结果

2.1 对小鼠急性毒性的影响

2.2 对大鼠亚急性毒性的影响

2.3 对正常小鼠肝、肾功能的影响

2.4 对正常小鼠胃肠功能的影响（胃排空及肠推进）

3 小结

第三部分酒蒸黄连"止消渴"药效物质基础研究

第一节基于糖尿病大鼠模型的酒蒸黄连入血化学成分初步分析

1 实验材料

2 实验方法及结果

2.1 入血成分分析条件的优化

2.2 酒蒸黄连的入血成分初步研究

3 小结

第二节基于3T3-L1前脂肪细胞的酒蒸黄连改善R药效物质基础探析

1 实验材料

2 实验方法与结果

2.1 3T3-L1前脂肪细胞的培养、分化及鉴定

2.2 药物对3T3-L1前脂肪细胞诱导分化的影响（油红O法）

2.3 药物对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗（IR）模型葡萄糖利用的影响

3 小结

第四部分酒蒸黄连"止消渴"炮制机理研究

第一节基于药材性状、显微变化的酒蒸黄连炮制机理

1 实验材料

2 实验方法及结果

2.1 黄连药材酒蒸炮制前后的形状描述

2.2 黄连药材酒蒸炮制前后的显微特征

3 小结

第二节基于化学成分变化的酒蒸黄连炮制机理

第三节基于体内药动学过程的酒蒸黄连炮制机理

1 实验材料

2 实验方法及结果

2.1 血清中黄连5种小檗碱型生物碱浓度的测定方法

2.2 黄连炮制前后分别在大鼠体内的药动学过程研究

3 小结

第五部分酒蒸黄连"止消渴"的药效机制

第一节基于3T3-L1前脂肪细胞的酒蒸黄连药效机制

1 实验材料

2 实验方法及结果

2.1 3T3-L1前脂肪细胞的正常培养

2.2 对3T3-L1前脂肪细胞PPARs蛋白表达的影响（Western bloting）

2.3 对3T3-L1前脂肪细胞PPARs mRNA表达的影响（RT-PCR）

3 小结

第二节基于2型糖尿病大鼠模型的酒蒸黄连药效机制

1 实验材料

2 实验方法及结果

3 小结

第六部分实验总结

讨论

1 酒蒸黄连"止消渴"的药效作用及其机制探讨

1.1 2型糖尿病发病机制探讨

1.2 动物模型的评价

1.3 酒蒸黄连"止消渴"的药效作用及其机制

2 酒蒸黄连"止消渴"的药效物质基础探讨

2.1 酒蒸黄连入血化学成分分析条件的优化

2.2 酒蒸黄连的入血成分初步分析

2.3 基于胰岛素抵抗活性的酒蒸黄连药效物质基础探析

3 酒蒸黄连"止消渴"的炮制机理初探

3.1 基于药材性状、显微变化的酒蒸炮制机理

3.2 基于化学成分变化的酒蒸炮制机理

3.3 基于体内药动学过程的酒蒸炮制机理

结论

创新点

问题与展望

参考文献

文献综述

参考文献

致谢

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