论文摘要
子宫内膜异位症（endometriosis,EM）是子宫内膜腺体和间质种植于子宫以外的雌激素依赖性疾病。而细胞色素芳香化酶P450（P450arom）在EM病理过程中起重要作用,目前采用芳香化酶抑制剂治疗EM取得了较满意的结果。最新研究表明植物雌激素可以抑制P450arom的表达和活性。葛根素是从中药葛根中提取的异黄酮类植物性雌激素,我们认为葛根素很可能成为治疗EM十分有潜力的药物。前期动物实验显示:葛根素能明显抑制EM大鼠异位灶的生长及异位灶组织P450arom的表达。本研究拟探讨葛根素抑制P450arom表达的调控机制,为其临床应用提供理论依据。研究内容:①葛根素对RL95-2细胞P450arom表达的影响。②葛根素对RL95-2细胞P450arom基因表达调控的作用。③siRNA抑制c-jun表达后对RL95-2细胞P450arom表达的影响。研究方法:①将梯度稀释的葛根素在不同时间点加入RL95-2细胞中,分别采用Real-time PCR及Western blotting方法检测药物对RL95-2细胞中P450arommRNA及蛋白表达水平的影响。再通过酶促反应采用放射免疫法检测E2水平,了解P450arom活性的变化。②以人类基因组DNA为模板扩增人P450arom组织特异性启动子2（PⅡ）转录起始位点上游序列。PCR产物定向克隆到报告基因载体pGL3-Basic中,分析转录因子并予缺失截断,构建人P450arom PⅡ系列报告基因质粒,并经限制性内切酶消化鉴定和基因测序证实。瞬时转染系列重组质粒至RL95-2细胞,加入葛根素刺激,应用荧光素酶活性检测系统（Luciferaseactivity assay）明确葛根素的作用片段,并分析此片段的转录因子,利用Real-time PCR及Western blotting方法检测相关转录因子在葛根素作用下mRNA及蛋白表达的变化,同时采用Luciferase activity assay检测葛根素对相关转录因子活性的影响。③采用siRNA抑制相关转录因子表达后,再次检测RL95-2细胞中P450arom在mRNA、蛋白以及酶活性水平的变化。研究结果:①Real-time PCR检测结果表明在不同浓度葛根素作用下细胞中P450arom mRNA表达呈双向作用趋势。与溶剂对照组比较高浓度葛根素刺激P450arom mRNA表达（P＜0.01）,而低浓度葛根素抑制其表达（P＜0.01）。并以抑制作用最明显的浓度(10-7mol/L)制时间曲线,结果显示抑制作用在6h和12h时间点较为显著（P＜0.01）。Western blotting结果表明,经高浓度葛根素(10-3mol/L)处理后,RL95-2细胞中P450arom蛋白表达在24h时间点明显增强,而葛根素(10-7mol/L)处理后其蛋白表达在12h和24h时间点出现明显抑制。E2检测结果表明,高、低浓度葛根素(10-3mol/L、10-7mol/L)在48h时间点与溶剂对照组比较分别刺激和抑制E2水平,具有统计学意义（P＜0.05）,同时阳性对照组（来曲唑）对E2的抑制作用更为显著（P＜0.01）。②经酶切鉴定、基因测序、转录因子分析及启动子活性测定,成功构建了人P450arom（PⅡ）系列重组质粒（-1017,-763,-543,-234～+8bp）。瞬时转染系列质粒至细胞中,于12h后加入葛根素（10-7mol/L）刺激,又12h后检测荧光蛋白水平。结果表明:-763bp～-543bp间的活性被抑制（P＜0.05）,通过转录因子分析找到了-410/-401bp的AP-1（c-jun/c-fos）。利用Real-time PCR、Western blotting及Luciferase activity assay检测发现葛根素(10-7mol/L)对AP-1（c-jun/c-fos）的抑制作用平行于对P450arom的作用。③Real-time PER检测结果表明c-jun siRNA沉默其mRNA表达（P＜0.01）,同时P450arom mRNA表达明显下降（P＜0.01）。Western blotting及E2检测结果表明,c-jun siRNA瞬时转染到细胞中,P450arom蛋白表达及E2水平分别在12h和48h时间点被抑制（P＜0.05）。研究结论:①葛根素对RL95-2细胞P450arom的作用具有双向性,低浓度抑制P450arom表达及活性,而高浓度起刺激作用。②成功构建人P450arom（PⅡ）系列报告基因质粒。葛根素(10-7mol/L)对位于-410/-401bp的c-jun的表达及AP-1的活性具有抑制作用,这与其对P450arom的抑制作用相一致。③siRNA抑制c-jun表达后,RL95-2细胞中的P450arom的表达和活性被抑制。
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