始旋链霉菌基因组重排育种、普那霉素发酵条件优化及高产机理分析

论文摘要

普那霉素（pristinamycin）是由始旋链霉菌（Streptomycespristinaespiralis）产生的一种链阳性菌素类（Streptogramin）抗生素,包含普那霉素Ⅰ（PⅠ）和普那霉素Ⅰ（PⅡ）两类化合物,对大多数革兰氏阳性菌,如MRSA、MRSE等均具有较强的杀菌活性,且抗生素后效应较长,被视为治疗顽固性革兰氏阳性菌感染的特选药物。目前,普那霉素已经在国外实现商品化生产,我国还未进行工业生产。因此,作为药效优良的抗生素,对普那霉素进行深入的研究和开发具有重要意义。本论文以提高普那霉素的发酵水平为目标,对始旋链霉菌的基因组重排、高产菌株培养基成分和培养条件优化以及高产菌产物合成分子机理等进行了深入细致的研究,获得了如下主要研究结果:1.以S.pristinaespiralis 0957作为原始菌株,利用紫外诱变获得四株普那霉素产量和耐受性都有所提高的菌株作为基因组重排的出发菌株。对始旋链霉菌原生质体制备和再生过程进行了研究,确定了合适的制备方案为:添加0.6%的甘氨酸到种子培养基中培养菌丝,用2%的溶菌酶在32℃下酶解1.5h。始旋链霉菌的原生质体制备率和原生质体再生率分别达到了95.8%和18.1%。2.对四株出发菌株（M-23、M-79、M-113和M-156）连续以原生质融合的方式进行基因组重排,然后以普那霉素自身耐受性的提高作为筛选依据,获得了一株高产突变菌株G4-17,它的原生质体对普那霉素耐受性高达100μg/mL,摇瓶培养时普那霉素产量达到0.89g/L,比产量最高的亲本菌株提高了89.4%,比原始出发菌株提高了145.9%。通过连续传代实验,确定高产菌株G4-17的遗传稳定性良好。3.研究了S.pristinaespiralis G4-17菌株的摇瓶发酵条件,通过正交设计对发酵培养基进行了优化;考察了摇瓶培养条件对菌体生长和产物合成的影响。优化后的发酵培养基组成为:可溶性淀粉3.0%、蔗糖1.0%、葡萄糖0.5%、麦芽糖0.8%、黄豆饼粉1.2%、蛋白胨0.4%、鱼粉1.2%、酵母粉0.6%、（NH4）2SO40.2%、MgSO40.35%、KH2PO40.02%、CaCO30.4%、NaNO3 0.075%;优化的摇瓶培养条件为:初始pH值为6.5,在25mL/250mL三角瓶中以6%接种量接入经过36h培养的种子培养液,在25℃、220rpm条件下进行培养60h,S.pristinaespiralis G4-17的普那霉素产量达到了1.21g/L,比优化前的产量（0.89g/L）提高了40.0%。在5-L发酵罐上,优化后的培养条件更有利于高产菌种G4-17合成,G4-17在培养60h时普那霉素产量达到最大值1.237g/L。4.利用ApaⅠ/TaqⅠ双酶切的AFLP技术对3支筛选出的普那霉素高产菌株以及它们的原始菌株CGMCC 0957进行了遗传多态性研究。结果显示,高产菌株间具有类似的AFLP指纹图谱,相比而言,高产菌株与原始菌株间的AFLP指纹图谱差异稍大。因此,在这些高产菌株特别是产量水平类似的菌株中存在类似的变异机理导致了普那霉素的产量提高。另外,AFLP分析还表明基因组重排技术较传统诱变育种更容易使微生物菌株产生基因组水平的变异,因此,利用基因组重排技术进行微生物育种工作较传统诱变育种技术更为有效。5.利用RT-PCR技术检测了普那霉素生物合成相关基因及其抗性基因在高产菌株G4-17和原始菌株CGMCC 0957表达的丰度变化,分析了这些基因表达水平与合成普那霉素的关系。结果显示PⅠ组分生物合成相关基因snbA在高产菌株的整个发酵进程中始终保持高丰度表达,而原始菌株只在发酵前期（24～48h）高丰度表达,随后逐渐降低。因此snbA基因的持续高表达与高产菌株的PⅠ组分高产密切相关。PⅡ组分生物合成基因snaB基因在在这两个菌株的发酵过程中表达丰度变化与snbA基因的表达变化类似,表明snaB基因的持续高表达与高产菌株的PⅡ组分高产密切相关。其它两个PⅡ组分生物合成基因snaA、snaC在高产菌株和原始菌株的发酵过程中无明显差异。研究还发现,对普那霉素产生抗性的ptr基因在高产菌株的整个发酵进程中表达丰度较高,而在原始菌株中仅在发酵中后期（48～96h）保持较高丰度表达。因此,ptr基因在高产菌株开始合成普那霉素之前就已经高表达,从而建立起了自我保护性抗性,这种抗性的提前建立与普那霉素高产密切相关。另外,普那霉素生物合成的调控基因spbR在高产菌株和原始菌株发酵过程中的基因表达丰度没有显著变化,表明这个调控基因的表达与普那霉素产量变化无显著相关性。6.利用蛋白质组学的一些基本研究手段对始旋链霉菌细胞裂解方法,裂解液的选择进行了实验比较,结果发现,液氮研磨法和硫脲裂解液更适合始旋链霉菌细胞内总蛋白的提取;对不同发酵时间高产菌株和原始菌株、抗生素产生前期与抗生素产生高峰期始旋链霉菌细胞内总蛋白含量和种类的差异进行了比较,结果发现,高产菌株G4-17总蛋白质含量高于原始菌株CGMCC 0957,同一菌株在发酵生产前期的蛋白质含量比后期高。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 普那霉素的研究进展
• 1.1.1 普那霉素的化学结构
• 1.1.2 普那霉素的理化性质
• 1.1.3 普那霉素的作用机制
• 1.1.4 普那霉素的抗菌活性
• 1.1.5 普那霉素的临床应用
• 1.1.6 普那霉素合成的相关基因概述
• （1） 普那霉素Ⅰ的生物合成
• （2） 普那霉素Ⅱ的生物合成机理
• （3） 普那霉素生物合成的调控基因
• （4） 普那霉素的抗性基因
• （5） 普那霉素的生物合成基因和抗性基因的分布
• 1.2 基因组重排技术
• 1.2.1 基因组重排技术的产生
• 1.2.2 基因组重排技术的原理
• 1.2.3 基因组重排的方法
• 1.2.4 基因组重排的特点
• 1.2.5 基因组重排技术在工业微生物育种中的应用
• ① 提高微生物合成初级代谢产物的能力:
• ② 提高微生物合成次级代谢产物的能力:
• ③ 提高微生物降解污染物的能力
• 1.3 AFLP技术的简介
• 1.3.1 AFLP技术的产生
• 1.3.2 AFLP技术的原理
• 1.3.3 AFLP的技术流程
• 1.3.4 AFLP的优点
• 1.3.5 AFLP技术的不足
• 1.4 RT-PCR技术的简介
• 1.4.1 RT-PCR的产生
• 1.4.2 RT-PCR的原理
• 1.4.3 RT-PCR实验的关键步骤
• ① mRNA的提取
• ② 提取的mRNA的质量检测
• ③ RT-PCR反应
• 1.4.4 RT-PCR在基因表达方面的应用
• 1.5 蛋白质组学简介
• 1.5.1 蛋白质组学的产生
• 1.5.2 蛋白质组和蛋白质组学的概念
• 1.5.3 蛋白质组学研究途径
• 1.5.4 蛋白质组学研究的不足与展望
• 1.6 本论文的研究思路和目标
• 第二章 普那霉素高产菌株的选育
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.2 培养基及培养条件
• 2.2.3 溶液配制
• 2.2.4 主要设备和仪器
• 2.2.5 孢子悬液的制备
• 2.2.6 紫外诱变和出发菌株的选择
• 2.2.7 菌丝体的培养和收集
• 2.2.8 原生质体制备
• 2.2.9 原生质体融合
• 2.2.10 基因组重排
• 2.2.11 还原糖和总糖测定
• 2.2.12 氨基氮测定
• 2.2.13 菌体干重测定
• 2.2.14 普那霉素测定
• 2.2.15 遗传稳定性实验
• 2.2.16 发酵罐实验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 紫外诱变时间的确定
• 2.3.2 出发菌株的选择
• 2.3.3 原生质体的制备及再生
• 2.3.3.1 甘氨酸浓度对原生质体制备与再生的影响
• 2.3.3.2 溶菌酶浓度对原生质体制备与再生的影响
• 2.3.3.3 酶解时间对原生质体制备与再生的影响
• 2.3.3.4 酶解温度对原生质体制备与再生的影响
• 2.3.4 始旋链霉菌原生质体对自身产物耐受性的提高
• 2.3.5 普那霉素产量的提高
• 2.3.6 突变株的遗传稳定性试验
• 2.3.7 高产菌株和原始菌株菌落形态的比较
• 2.3.8 高产菌株与原始菌株在5L发酵罐中培养时生化特性的比较
• 2.4 本章小结
• 第三章 基因组改组菌株发酵条件的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 菌株
• 3.2.1.2 初始发酵培养基:
• 3.2.1.3 主要试剂:
• 3.2.2 主要设备
• 3.2.3 主要溶液
• 3.2.3.1 中性甲醛溶液（18%）
• 3.2.3.2 酚酞溶液（1%）
• 3.2.3.3 甲基红溶液（0.1%）
• 3.2.3.4 结晶紫染液
• 3.2.3.5 DNS试剂
• 3.2.4 还原糖和总糖测定
• 3.2.5 氨基氮测定
• 3.2.6 菌体干重测定
• 3.2.7 普那霉素测定
• 3.2.8 5L发酵罐发酵实验
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 培养基成分的优化
• 3.3.1.1 碳源对产物合成的影响
• 3.3.1.2 氮源对产物合成的影响
• 3.3.2 培养条件的优化
• 3.3.2.1 种龄对产量的影响
• 3.3.2.2 接种量对产量的影响
• 3.3.2.3 发酵初始pH对产量的影响
• 3.3.2.4 发酵温度的产量的影响
• 3.3.3 发酵过程曲线
• 3.3.4 发酵罐上优化效果的比较
• 3.4 本章小结
• 第四章 始旋链霉菌基因组的多态性研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 主要试剂:
• 4.2.3 主要设备
• 4.2.4 培养基
• 4.2.5 缓冲液
• 4.2.6 培养方法
• 4.2.7 基因组DNA的提取和纯化
• 4.2.8 基因组DNA的检测
• 4.2.9 基因组DNA的酶切
• 4.2.10 酶切产物和接头的连接
• 4.2.11 预扩增反应
• 4.2.12 选择性扩增反应
• 4.2.13 变性聚丙烯酰胺凝胶和银染显色
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 DNA提取和双酶切效果检验
• 4.3.2 预扩增
• 4.3.3 选择性扩增
• 4.4 本章小结
• 第五章 与普那霉素合成相关的基因的表达丰度研究
• 5.1 引言
• 5.2.材料与方法
• 5.2.1 实验菌株和培养方法
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 主要设备
• 5.2.4 链霉菌菌株的培养
• 5.2.5 链霉菌总RNA的提取
• 5.2.6 粗提RNA样品的纯化
• 5.2.7 总RNA的检测
• 5.2.8 反转录反应（RT反应）
• 5.2.9 PCR扩增产物电泳分析
• 5.3 结果和分析
• 5.3.1 总RNA粗提样品电泳分析
• 5.3.2 纯化后RNA样品电泳分析
• 5.3.3 RNA浓度的测定及分析
• 5.3.4 高产菌株和原始菌株的不同发酵时间的基因表达丰度变化
• 5.3.4.1 核糖体RNA（rRNA）基因表达丰度分析
• 5.3.4.2 ptr抗性基因表达丰度分析
• 5.3.4.3 spbR调控基因表达丰度分析
• 5.3.4.4 结构基因表达丰度分析
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 第六章 始旋链霉菌蛋白质组学的初步研究
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料
• 6.2.1 菌株
• 6.2.2 培养基
• 6.2.3 主要材料与溶剂
• 6.2.4 溶液配制
• 6.2.5 主要设备和仪器
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 培养方法
• 6.3.2 细胞裂解方法
• 6.3.3 蛋白质含量测定（Bradford法）
• 6.3.4 单向聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 6.3.5 双向凝胶电泳
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 蛋白质浓度标准曲线
• 6.4.2 细胞破碎方法的比较
• 6.4.3 裂解液的选择
• 6.4.4 原始菌株和高产菌株细胞内总蛋白质浓度的比较
• 6.4.5 SDS-PAGE电泳
• 6.4.6 出发菌株与诱变高产菌株的双向电泳图谱分析
• 6.5 讨论
• 6.6 本章小结
• 参考文献
• 作者简历