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靶向双功能水蛭素在毕赤酵母中表达的研究

2020-12-02阅读(465)

靶向双功能水蛭素在毕赤酵母中表达的研究

论文摘要

水蛭素（Hirudin）是存在于医用水蛭（Hirudo medicinalis）唾液腺中的低分子量蛋白质,是凝血酶的特异性抑制剂。水蛭素对凝血酶有很高的亲和力,它与凝血酶形成摩尔比为1:1的非共价结合的可逆复合物,是一种很好的防治血栓的药物。用它作为防治血栓的药物有诸多优点:专一性强,直接特异性抑制凝血酶活性,不良反应少而轻;分子量小,几乎没有抗原性;小分子蛋白质,几乎没有毒性;抗栓作用稳定、持久。同时水蛭素也存在一些问题,极大地影响了水蛭素的临床应用:①水蛭素抗凝血的同时也延长了出血时间,过量容易引起非溶栓部位出血;②对水蛭素所致出血没有良好的对抗药物;③水蛭素只具有抗凝血酶活性,能有效地防治静脉血栓,而不能防治动脉血栓。因此为了减少天然水蛭素出血的副作用和增加其防治动脉血栓的活性,本课题基于对天然水蛭素构效关系的深入研究,在保留天然水蛭素原有活性的基础上,将FXa识别序列融合到水蛭素N端以增强水蛭素的靶向性而减少出血副作用;将Arg-Gly-Asp（RGD）三肽序列融合在水蛭素的合理部位以增强抗血小板聚集作用而增加其防治动脉血栓的活性。同时,在目的蛋白N端增加一个9×His Tag以便于蛋白的分离纯化,以期为大量生产靶向双功能水蛭素提供有效的基因工程手段。本课题根据设计的融合蛋白氨基酸序列和毕赤酵母的密码子偏好性,设计了六条引物经三轮PCR获得目的基因。将目的基因与毕赤酵母载体pPIC9K质粒重组构建表达质粒,电转化毕赤酵母GS115宿主菌,经G418筛选得到高表达的阳性克隆,鉴定为甲醇利用快型（Mut+）,在摇瓶中实现融合蛋白的高效、稳定和分泌性表达。培养液上清经超滤离心、亲和层析纯化到单一的目的蛋白,经蛋白酶切和Western bloting验证,并通过凝血酶滴定法测定目的蛋白抗凝血酶比活性和天然水蛭素几乎没有差别。为进一步优化表达条件、分析目的蛋白的功能奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 1 绪论
  • 1.1 课题的提出及研究意义
  • 1.1.1 课题的提出
  • 1.1.2 研究的意义
  • 1.2 国内外研究现状
  • 1.2.1 水蛭素临床应用的研究现状
  • 1.2.2 水蛭素衍生物的研究现状
  • 1.2.3 重组水蛭素表达的研究现状
  • 1.3 本文研究的目的和研究内容
  • 1.3.1 研究的目的
  • 1.3.2 研究的主要内容
  • 2 靶向双功能水蛭素的基因构建
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与仪器
  • 2.2.1 材料
  • 2.2.2 仪器
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 设计并合成引物
  • 2.3.2 靶向双功能水蛭素基因的PCR 扩增
  • 2.3.3 融合蛋白基因的T-载体连接及转化
  • 2.3.4 表达载体pPIC9K-r-HV 的构建与鉴定
  • 2.4 实验结果
  • 2.4.1 目的基因的拼接克隆
  • 2.4.2 pPIC9K 表达载体的构建
  • 2.5 本章小结
  • 3 目的基因的毕赤酵母转化和表达
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与仪器
  • 3.2.1 材料
  • 3.2.2 仪器
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 转化酵母菌的线性化质粒制备
  • 3.3.2 GS115 酵母菌株的分离纯化
  • 3.3.3 GS115 酵母感受态细胞的制备
  • 3.3.4 线性化质粒电转化 GS115
  • 3.3.5 重组转化子的抗性筛选和表型鉴定
  • 3.3.6 重组转化子的PCR 检测确定
  • 3.3.7 重组转化子的初步诱导表达
  • 3.3.8 SDS-PAGE 检测蛋白表达量
  • 3.3.9 Western-Blot 验证蛋白表达
  • 3.3.10 凝血酶滴定法验证重组蛋白的抗凝活性
  • 3.4 实验结果
  • 3.4.1 重组质粒的线性化
  • 3.4.2 阳性转化子的筛选
  • 3.4.3 阳性转化子的PCR 鉴定
  • 3.4.4 阳性转化子的诱导表达
  • 3.4.5 上清液抗凝活性的分析
  • 3.5 本章小结
  • 4 融合蛋白的分离纯化及抗凝活性鉴定
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与仪器
  • 4.2.1 材料
  • 4.2.2 仪器
  • 4.3 实验方法
  • 4.3.1 高表达菌株的摇瓶表达
  • 4.3.2 上清液的超滤离心
  • 4.3.3 目的蛋白的亲和层析
  • 4.3.4 BCA 法测定蛋白浓度
  • 4.3.5 蛋白酶切验证纯化的目的蛋白
  • 4.3.6 凝血酶滴定法测定目的蛋白的凝血酶比活性
  • 4.4 实验结果
  • 4.4.1 目的蛋白的纯化
  • 4.4.2 纯化产物的SDS-PAGE 检测
  • 4.4.3 纯化产物的Western-Blot 鉴定
  • 4.4.4 纯化产物的蛋白酶切
  • 4.4.5 目的蛋白活性的测定
  • 4.5 本章小结
  • 5 结论与展望
  • 5.1 主要结论
  • 5.2 展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录

    • 相关论文文献

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