论文摘要
结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，腺瘤—癌的序列变化是多数结直肠癌病人的发病模式，是多种癌基因突变或抑癌基因失活改变累积的结果。研究表明结直肠癌有两种基因组不稳定途径：微卫星不稳定途径和染色体不稳定途径这两种途径的发现使结直肠癌成为一种遗传异质性疾病。微卫星不稳定（MSI）指微卫星序列中重复单位的获得或缺失，多由于DNA错配修复系统缺陷引起，约90％HNPCC中存在，MSI在HNPCC中已经成为的重要标志物，但在散发性结肠癌中，国内外报道尚不一致。我们应用荧光标记多重PCR法扩增微卫星位点BAT25和BAT26，检测SCRC中的微卫星不稳定状态，并探讨其与临床病理特征的关系。细胞核DNA的含量可直接反映肿瘤细胞增殖状态，在判断肿瘤的恶性程度及预后方面有重要意义。我们应用流式细胞术检测SCRC肿瘤细胞的DNA倍体，分析其与结直肠癌临床病理特征的关系，并探讨其与微卫星不稳定的关系。染色体不稳定包括整条染色体的获得或缺失、染色体易位、重排等，约有60％的结直肠癌是经过染色体不稳定途径发生的。微卫星不稳定与染色体不稳定是结直肠癌基因组不稳定的两种主要形式，两种类型结直肠癌在基因表达及临床特征上都有一定差异，但两种机制之间的关系尚不清楚。我们采用CGH技术在全基因组水平对SCRC进行染色体变异的检测，分析染色体变异与临床特征之间的关系，并探讨染色体变异与DNA倍体及微卫星不稳定的关系。本研究分为三个部分：第一部分散发性结直肠癌的微卫星不稳定研究目的：检测SCRC中的微卫星不稳定状态，并探讨其与临床病理特征的关系。方法：将微卫星位点的PCR引物在进行荧光标记，应用荧光标记多重PCR法扩增微卫星位点BAT25和BAT26，将PCR扩增产物在荧光毛细管中进行电泳，以GenScan3．1软件扫描分析两个微卫星位点状况。结果：112例SCRC患者中，BAT25和BAT26两个位点均阳性者14例，MSI-H发生率为12．5％（14／112）；MSI-L发生率为8．9％（10／112），其中BAT25单位点阳性者4例，BAT26单位点阳性者6例；两个位点均阴性者88例，MSS发生率为78．6％。散发性结直肠癌中MSI-H和MSS两组的比较显示：MSI-H者发病部位以近端结肠癌多见（P=0．034），组织学类型以粘液腺癌、印戒细胞癌相对多见（P=0．023），分化程度以低分化癌多见（P=0．039），而MSI-H与MSS两者在性别、年龄、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移等方面无明显统计学差异。第二部分散发性结直肠癌的DNA倍体分析目的：检测结直肠癌患者肿瘤细胞的DNA含量，探讨DNA倍体与结直肠癌临床病理特征及微卫星不稳定的关系。方法：应用流式细胞术检测40例SCRC（14例MSI-H，26例MSS）肿瘤细胞的DNA倍体。结果：40例结直肠癌标本中，二倍体为17例，占42．5％，异倍体为23例，异倍体的比例为57．5％。散发性结直肠癌的DNA倍体与患者的性别、年龄及组织学类型无明显相关性。直肠癌的异倍体发生率高于结肠癌，低分化癌异倍体发生率高于高、中分化癌，但均未达到统计学差异（P＞0．05）。DNA倍体与患者的的TNM分期有密切关系，分期越高，异倍体的比例越高，统计学有显著差异（P=0．005）。MSI-H的SCRC多为二倍体（71．4％），而MSS组多为异倍体（73．1％），两组的差别具有统计学意义（P=0．009）。第三部分比较基因组杂交研究散发性结直肠癌的染色体变异目的：检测散发性结直肠癌的染色体变异，并了解其与临床病理特征、DNA倍体及微卫星不稳定之间的关系。方法：采用CGH技术在全基因组水平对40例SCRC（14例MSI-H，26例MSS）进行染色体变异的检测。结果：在CGH检测的40例散发性结直肠癌中，所有病例均有不同程度的染色体臂发生扩增或丢失。平均每例变异数为7．55，其中扩增数为4．73，丢失数为2．83。常见的染色体扩增区域有：20q、12q、13q、7p、7q和16q。常见缺失区域有18q、5q、4q、8p和17p。TNM分期中Ⅲ、Ⅳ期结直肠癌的染色体总变异数和扩增数、缺失数均高于Ⅰ、Ⅱ期。肿瘤部位、组织学类型、分化程度等与染色体总变异数、扩增数和丢失数之间均无统计学相关性。20q的扩增与TNM分期有关，其他常见扩增或缺失区域与结直肠癌的临床分期之间均无统计学相关性。二倍体肿瘤的染色体总变异数及缺失数明显少于异倍体，各染色体区域之间未达到统计学意义。MSI-H肿瘤的染色体总变异数及缺失数少于MSS肿瘤。MSS肿瘤中20q扩增和17p缺失明显高于MSI-H，其余染色体区域未达到统计学意义。结论1．MSI是SCRC常见的分子事件，MSI-H者具有独特的临床病理特征。2．SCRC中存在二倍体与异倍体，异倍体的比例与患者的的TNM分期有关。MSI-H的SCRC多为二倍体，MSS多为异倍体。3．染色体变异在SCRC中普遍存在，比DNA倍体的异常更为常见。4．SCRC中染色体变异数及20q的扩增与TNM分期有关。5．二倍体肿瘤的染色体变异数少于异倍体肿瘤。6．MSI-H肿瘤的染色体变异频数及部位与MSS肿瘤存在差异，两者可能在基因表达和涉及的转导通路方面存在差异。