猪水泡病毒VP1基因克隆、表达及其检测技术的研究

论文摘要

猪水泡病（SVD）又名猪传染性水泡病，是由猪水泡病毒（SVDV）引起的一种烈性传染病，以口和蹄部产生水泡性损伤为特征，其临床症状与猪口蹄疫（FMD）极为相似，不容易区别，严重阻碍我国畜牧业和动物及其产品国际贸易的发展，引起严重的公共卫生问题，国际兽医局（OIE）将这疫病列为A类传染病。在国际贸易中，多数国家对SVD采取严格的检疫和控制措施已成为一种技术性贸易保护壁垒。猪水泡病和水泡性口炎（VSV）及口蹄疫临床症状相似，需要进行鉴别诊断，因此建立敏感性高、特异性强，快速、安全和可靠的诊断方法对于猪水泡病、水泡性口炎、口蹄疫的控制和出入境检验检疫至关重要。本研究应用基因克隆、基因表达等技术，对猪水泡病病毒外壳蛋白抗原（VP1）编码基因进行了克隆，构建于原核表达载体，高效表达目的蛋白，应用表达产物建立了酶联免疫吸附试验（ELISA），同时建立了猪水泡病RT-PCR、多重RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR核酸检测方法，并进行了相关病毒核酸的鉴别检测，其主要内容和结果为：1．以猪水泡病病毒核酸为模板，反转录聚合酶链式反应，扩增获得849bp的VP1基因，通过T-A克隆，将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中，构建SVDV VP1基因重组质粒，并进行核苷酸序列测定确定其基因的正确性。再将片断插入pBAD／Thio TOPO表达载体，经测序鉴定，筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆，成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达，可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明，以终浓度为0.002％的L—阿拉伯醛糖进行诱导，5h后表达可达到高峰，表达蛋白为融合蛋白，分子量为47.13kDa，表达产量约占菌体总蛋白的16％。Western blotting检测表明，诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。应用该重组抗原建立了检测猪水泡病的间接ELISA方法，以重组的猪水泡病病毒VP1蛋白为包被抗原，建立了以重组VP1蛋白为抗原检测SVDV抗体的酶联免疫吸附试验。2．根据基因库中的猪水泡病病毒高度保守的序列，设计了与SVDV互补的特异性引物，成功地建立了RT-PCR检测方法，扩增出251bp和366bp特异性条带，本试验能稳定、高效、快速地检测出猪水泡病病毒。通过检测FMDV、VSV、BHK21细胞等，对照的扩增结果均为阴性，证明该方法可特异性扩增目的基因。对SVDV RNA进行10倍系列稀释后检测，结果SVDV RNA在10-4稀释度时仍能检测到阳性，说明该方法具有较好的敏感性。3．应用RT-PCR技术，建立了多重PCR同时检测鉴别口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎病毒的方法。根据基因库中的口蹄疫病毒、猪水泡病病毒和水泡性口炎病毒各基因的序列，设计了与FMDV、SVDV、VSV互补的3对特异性引物，对样品中的cDNA模板进行了多重RT-PCR扩增及反应条件的优化，结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带，分别为189bp、125bp和300bp。用这3对引物对病毒样品cDNA模板进行多次扩增，均能稳定得到与设计相符合的3条特异性条带。本试验能同时特异、敏感、快速地鉴定FMDV、SVDV和VSV。4．建立了实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测猪水泡病病毒的方法。根据基因库中的SVDV高度保守的序列，设计合成引物和TaqMan探针，经各反应条件的优化，建立了实时荧光定量PCR技术。对SVDV进行了特异性、敏感性和重复性试验，结果表明，实时荧光TaqMan RT-PCR可检测到每个反应相当于1×102copies病毒RNA；与FMDV、VSV等其它水泡性病毒不发生交叉反应；制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽，相关系数为0.993；与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。可对样品中微量SVDV进行准确检测，是一种SVDV检测的良好方法。综上所述，本研究成功表达了猪水泡病病毒VP1基因，应用表达产物建立了酶联免疫吸附试验；并建立了猪水泡病RT-PCR、多重PCR、实时荧光定量RT-PCR核酸检测方法。该检测体系对于猪水泡病的预防和控制、出入境检验检疫以及社会公共安全显得至关重要，为我国猪水泡病的诊断和动物检疫提供了技术支撑。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 猪水泡病研究进展
• 1.1 SVDV病原学
• 1.1.1 病毒分类与特性
• 1.1.2 基因组结构
• 1.1.3 病毒蛋白质的结构和功能
• 1.1.4 SVDV的抗原结构
• 1.2 SVDV流行病学
• 1.2.1 流行与危害
• 1.2.2 病毒的繁殖与复制
• 1.2.3 SVDV的传播
• 1.3 SVDV诊断技术及其研究进展
• 1.3.1 动物试验
• 1.3.2 血清抗体检测方法
• 1.3.3 核酸诊断
• 1.4 SVD的控制和预防
• 1.5 本论文的研究目的和研究策略
• 第二章 猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要材料及试剂
• 2.2.2 主要试剂配制
• 2.2.3 引物设计
• 2.2.4 技术路线
• 2.2.5 病毒基因组RNA的提取
• 2.2.6 cDNA的反转录
• 2.2.7 SVDV-VP1基因的PCR扩增
• 2.2.8 PCR产物的小量胶回收
• 2.2.9 感受态细胞的制备
• 2.2.10 克隆及表达载体的构建
• 2.2.11 重组表达质粒在TOPO10E.coli细胞中的诱导表达
• 2.2.12 SDS-PAGE分析表达蛋白
• 2.2.13 表达产物的Western blotting检测
• 2.2.14 重组蛋白的小批量生产和纯化
• 2.3 试验结果
• 2.3.1 目的片段的克隆与鉴定
• 2.3.2 SVDV VP1基因的亚克隆及重组表达质粒的构建
• 2.3.3 SVDV核蛋白表达重组质粒的序列分析
• 2.3.4 表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.3.5 表达产物的Western blotting检测
• 2.3.6 重组基因表达产物的纯化
• 2.4 讨论
• 2.4.1 VP1基因的选择
• 2.4.2 基因表达系统的选择
• 2.4.3 VP1基因表达
• 2.4.4 表达产物的纯化
• 第三章 猪水泡病检测技术的建立
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 病毒株、细胞和主要试剂
• 3.2.2 仪器设备
• 3.2.3 试剂配制
• 3.2.4 猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立
• 3.2.5 多重PCR检测口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎的研究
• 3.2.6 实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测猪水泡病病毒的研究
• 3.2.7 应用重组抗原建立检测猪水泡病抗体的间接ELISA方法的研究
• 3.3 结果
• 3.3.1 猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立
• 3.3.2 多重PCR检测口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎的研究
• 3.3.3 实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测猪水泡病病毒的研究
• 3.3.4 应用重组抗原建立检测猪水泡病抗体的间接ELISA方法的研究
• 3.4 讨论
• 3.4.1 猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立
• 3.4.2 多重PCR检测口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎的研究
• 3.4.3 实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测猪水泡病病毒的研究
• 3.4.4 应用重组抗原建立检测猪水泡病抗体间接ELISA方法的研究
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介