稻瘟菌激活蛋白基因pemG1在水稻和烟草中的表达及功能研究

论文摘要

蛋白激发子是诱导植物抗病性的重要信号分子,其与植物的受体蛋白识别后能诱发植物的防御反应。研究表明,来源于稻瘟菌（Magnaporthe grisea）的激活蛋白PemG1能促进种子萌发和幼苗生长,提高水稻对稻瘟病的抗性。为探讨PemG1蛋白在植物中诱导抗病性和促进生长的功能,本研究将稻瘟菌激活蛋白基因pemG1转化水稻和烟草,检测该基因在受体植物内的整合,转录和表达,分析转基因植株的抗病性和农艺性状。本研究获得的主要结果如下:（1）构建了稻瘟菌激活蛋白基因pemG1的植物表达载体,载体含有控制pemG1基因表达的玉米泛素启动子和章鱼碱合成酶基因终止子以及卡那霉素抗性基因nptⅡ（neomycin phosphotransfersⅡ）。对载体进行了酶切和测序检测,通过冻融法将载体转化了根癌农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）菌株AGL-1。（2）比较了B6、MS和NB三种培养基的培养效果,结果表明,NB培养基最适合于日本晴（Nipponbare）成熟胚的组织培养。通过根癌农杆菌介导转化,将pemG1基因转化日本晴和烟草（Nicotiana tabacum）,获得了转基因水稻和烟草植株,并将其繁育到T2代。（3）通过PCR检测确认了阳性转化株,用Southern杂交进一步证实了pemG1基因已整合到受体植物基因组,用RT-PCR和Northern杂交验证了pemG1基因在植物细胞中的转录,用Western杂交证实了pemG1基因在植物细胞中的表达。遗传分析表明,pemG1基因在转基因后代中的分离符合3∶1的理论比例。（4）比较了T0代转基因水稻植株和非转基因对照的农艺性状。转基因植株的平均株高为60.0 cm,非转基因对照的平均株高为43.6 cm。转基因植株平均收获到63.8颗饱满的种子,非转基因对照平均收获到42.6颗饱满的种子。（5）鉴定了T0代和T2代转基因水稻植株对稻瘟病的抗性。离体叶片接种试验,稻瘟菌孢子悬浮液喷雾接种试验和台盼兰染色的结果表明,和非转基因对照相比,转基因水稻植株对稻瘟病的抗性提高了36～56%。（6）鉴定了T2代转基因三生烟（Nicotiana tobacum cv. Samsun NN）对烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus）的抗性,转基因植株对枯斑的抑制率为35～47%。Northern杂交结果表明,pemG1基因的转录水平与枯斑抑制率存在相关性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 蛋白激发子
• 1.1.1 过敏蛋白Harpin
• 1.1.2 激发素Elicitin
• 1.1.3 激活蛋白Activator Protein
• 1.1.4 无毒蛋白
• 1.1.5 病毒激发子
• 1.2 转基因水稻
• 1.2.1 水稻转基因方法
• 1.2.2 水稻遗传转化中所用的外植体
• 1.2.3 水稻遗传转化中所用的培养基
• 1.2.4 水稻遗传转化中所用的目的基因
• 1.2.5 转基因水稻现存的问题和对策
• 1.3 转基因烟草
• 1.3.1 烟草转基因研究的意义
• 1.3.2 外源基因导入烟草的方法
• 1.3.3 烟草抗TMV 基因工程策略
• 1.4 转化子的筛选方法
• 1.4.1 用报告基因进行筛选
• 1.4.2 用选择标记基因进行筛选
• 1.5 转基因植物的检测方法
• 1.5.1 外源基因整合水平的检测
• 1.5.2 外源基因转录水平的检测
• 1.5.3 外源基因表达水平的检测
• 1.5.4 其它检测技术
• 1.6 转基因植物中外源基因的遗传稳定性
• 1.7 转基因植物的安全性
• 1.7.1 转基因植物对生物安全的影响
• 1.7.2 提高转基因植物安全性的策略
• 1.8 研究背景和意义
• 1.9 试验设计
• 第二章 稻瘟菌激活蛋白基因pemG1 植物表达载体的构建
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂和药品
• 2.1.3 转化水稻的植物表达载体的构建
• 2.1.4 转化烟草的植物表达载体的构建
• 2.1.5 植物表达载体转化根癌农杆菌
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 植物表达载体的酶切和测序检测
• 2.2.2 根癌农杆菌中植物表达载体的检测
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 转pemG1 基因植株的获得
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要试剂和药品
• 3.1.2 转pemG1 基因日本晴的获得
• 3.1.3 转pemG1 基因普通烟和三生烟的获得
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不同培养基在组织培养中的效果及转基因日本晴的获得
• 3.2.2 转基因普通烟和三生烟的获得
• 3.3 讨论
• 3.3.1 水稻组织培养培养基
• 3.3.2 籼稻的组织培养
• 3.3.3 筛选标记基因
• 3.3.4 关于水稻转基因的方法
• 3.4 小结
• 第四章 转pemG1 基因植株的分子检测
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 主要试剂和药品
• 4.1.2 主要溶液的配制
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.1.4 转基因植株的PCR 检测
• 4.1.5 转基因植株的Southern blot 检测
• 4.1.6 转基因植株的RT-PCR 及Northern blot 鉴定
• 4.1.7 转基因植株的Western blot 鉴定
• 4.1.8 转基因后代的遗传分析及纯合阳性株系的筛选
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 转基因水稻的分子鉴定
• 4.2.2 转基因烟草的分子鉴定
• 4.2.3 转基因后代的遗传分析
• 4.2.4 纯合转基因株系的筛选
• 4.3 讨论
• 4.3.1 关于转基因植物的分子检测方法
• 4.3.2 关于纯合转基因株系的筛选
• 4.4 小结
• 第五章 转pemG1 基因植株的抗病性和农艺性状
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 转基因水稻的稻瘟病抗性鉴定
• 5.1.2 转基因水稻的农艺性状观察
• 5.1.3 转基因三生烟的TMV 抗性鉴定和mRNA 检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 转基因水稻对稻瘟病的抗性
• 5.2.2 转基因水稻的生长性状
• 5.2.3 转基因三生烟对TMV 的抗性
• 5.2.4 pemG1 基因mRNA 积累水平与对TMV 抗性的相关性分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 稻瘟菌激活蛋白基因在水稻和烟草中的表达提高了转基因植株抗病性
• 5.3.2 稻瘟菌激活蛋白基因在水稻中的表达促进了水稻生长
• 5.3.3 转基因植物抗病性的稳定遗传
• 5.3.4 双拷贝转化子的后代用于抗病性试验的可行性
• 5.3.5 PemG1 蛋白诱导抗病性的机制
• 5.3.6 蛋白激发子应用前景分析
• 5.4 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历