晚疫病抗性信号传导研究体系的构建和番茄抗病资源的创新

论文摘要

晚疫病是危害茄科作物马铃薯和番茄最严重的病害之一,对番茄和马铃薯生产造成巨大的经济损失。近年来,马铃薯抗晚疫病基因克隆取得了很快的进展,已经有来源于野生种Solanum. demissum的R1和R3a及来源于S. bulbocastanum的RB和Rpi-blb2、Rpi-blb3被克隆。由于晚疫病进化潜力高,所以新的抗病基因很快就被新的生理小种克服,限制了抗病基因的利用。相似的情况也出现在番茄抗晚疫病研究中,番茄有四个抗晚疫病基因被定位,但这四个基因的在田间的应用效果也十分有限。因此探索已克隆抗病基因的抗病机理,了解抗病信号传导途径就显得尤为重要,发现信号途径中的关键基因必将为晚疫病的防治开辟一个新的领域。抗病基因R3a和无毒基因Avr3a是晚疫病研究中第一对被克隆的符合基因对基因假说的R-Avr基因对,它们的克隆为我们研究抗晚疫病信号途径提供了基础。本论文主要的研究内容与结果如下:1.利用VIGS和瞬时表达技术研究已知的信号传导关键基因是否参与R3a-Avr3a的互作。通过构建已知抗病信号传导关键基因EDS1、NDR1、RAR1、SGT1、HSP90、NPR1、NtWRKY1、SIPK1的VIGS载体,以烟草作为模式系统沉默上述八个基因后,再利用瞬时表达技术在已沉默基因的烟草叶片中瞬时表达R3a和Avr3a,结果表明在SGT1和HSP90基因沉默的烟草植株中,R3a和Avr3a互作的HR被阻断,说明这两个基因参与了R3a与Avr3a的HR反应,在R3a的抗病信号途径中起重要作用。2.将抗晚疫病基因R3a转入番茄,获了对马铃薯晚疫病菌小种特异性抗性的转基因植株,说明R3a基因抗病信号传导途径在番茄和马铃薯中的保守性,也为利用番茄研究马铃薯的抗病基因R3a提供了证据。为了发现新的R3a与Avr3a互作过程中的关键基因,我们构建了一个用于研究晚疫病抗病信号传导的系统。在R3a转基因番茄后代中利用皮脂激素诱导系统（GVG系统）诱导表达与R3a相对应的无毒基因Avr3a,获得的MM-R3a-Avr3a转基因植株叶片在涂抹或喷施化学诱导剂地塞米松（DEX）的情况下能够诱导类似HR反应的产生,该系统能够用来研究构建突变体库,筛选HR反应被阻断的突变体,用于R3a与Avr3a互作信号途径的研究。3.快速筛选MM-R3a-Avr3a转基因植株的纯合株系是建立突变体库的重要前提。利用连接接头的PCR方法,扩增R3a基因在番茄基因组中插入位点的侧翼序列,该序列与NCBI数据库中位于第四号染色体的编号为SLMboI-127L14的克隆有100%的相似性,说明R3a基因整合于番茄的第四号染色体上。Avr3a基因侧翼序列与SGN的番茄BAC末端数据库中编号为LEHBa0167K15SP613180的序列具有100%的同源性,但该BAC末端序列定位于哪条染色体目前未知。利用R3a和Avr3a的侧翼序列和边界序列的扩增,在转基因的T1代筛选到两个基因都纯合的MM-R3a-Avr3a植株。4.为了研究抗晚疫病基因R3a能否应用于番茄,我们对22份番茄晚疫病菌中的Avr3a等位基因进行了分析,结果表明R3a基因可以应用于部分地区番茄的抗晚疫病基因工程育种;除此之外,我们还将转R3a基因番茄和转另外两个马铃薯抗晚疫病基因R1和Rpi-blb1/RB的番茄植株,接种番茄晚疫病菌的主流小种和强致病力小种,证明马铃薯的抗晚疫病基因在番茄中对番茄的晚疫病菌株均具有一定的抗病功能,尤其是马铃薯抗晚疫病基因RB能够对番茄致病力最强的菌株产生抗性,为番茄的抗晚疫病基因工程育种提供了新的途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 马铃薯和番茄晚疫病
• 1.1.1 晚疫病对马铃薯和番茄生产的危害
• 1.1.2 晚疫病致病菌
• 1.1.3 番茄晚疫病菌与马铃薯的晚疫病菌
• 1.1.4 马铃薯和番茄抗晚疫病基因的研究
• 1.2 植物抗病的信号传导
• 1.2.1 植物的抗病性的类型
• 1.2.2 植物的抗病机制
• 1.2.3 抗病基因的结构域和功能
• 1.2.4 病原菌的无毒基因
• 1.2.5 植物抗病基因与病原无毒基因的识别
• 1.2.6 R 基因的下游信号传导的关键基因
• 1.2.7 茄科植物在病理研究中的关键地位
• 1.3 病毒诱导的基因沉默和农杆菌瞬时表达
• 1.3.1 病毒诱导的基因沉默的机理
• 1.3.2 VIGS 病毒载体及构建
• 1.3.3 VIGS 的优缺点及其安全性问题
• 1.3.4 农杆菌瞬时表达原理和应用
• 1.3.5 VIGS 方法与瞬时表达结合在植病互作研究中的应用
• 1.4 诱导表达系统的简介及其在病理研究中的应用
• 1.4.1 诱导表达系统的简介
• 1.4.2 化学诱导表达系统在抗病信号传导及其它研究领域的应用
• 1.5 侧翼序列扩增的方法、原理及其应用
• 1.6 论文的立题依据、研究目的及意义和研究内容
• 1.6.1 立题依据
• 1.6.2 研究的目的及意义
• 1.6.3 研究内容
• 第二章 利用VIGS 和瞬时表达研究R3a 和Av13a 互作的信号传导关键基因
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 VIGS 与瞬时表达体系建立
• 2.3.2 已知关键基因的VIGS 载体构建
• 2.3.3 VIGS 沉默后的RT-PCR 验证和烟草植株表型
• 2.3.4 SGT1 和HSP90 参与R3a 和 Av13a、INF1 诱导的HR 反应
• 2.4 讨论
• 2.4.1 烟草是利用VIGS 研究R3a 与Av13a 信号传导的模式体系
• 2.4.2 VIGS 和瞬时表达结合是研究抗病信号途径的有效方法
• 2.4.3 SGT1 和HSP90 参与R3a 与 Av13a 诱导的HR 反应
• 2.4.4 其它信号途径关键基因没有阻断R3a 与 Av13a 诱导HR 反应的原因
• 2.5 结论
• 第三章 晚疫病抗病信号传导研究系统的构建
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 R3a 转基因植株对马铃薯晚疫病菌株显示小种特异性抗性
• 3.3.2 pTA7002：Av13a 载体的构建
• 3.3.3 MM-R3a-Av13a 植株的构建及Av13a 的诱导表达
• 3.3.4 诱导剂DEX 处理MM-R3a-Av13a 植株
• 3.4 讨论
• 3.4.1 马铃薯抗病基因可应用于番茄
• 3.4.2 番茄可以作为R3a 与Av13a 信号传导途径研究的模式系统
• 3.4.3 构建MM-R3a-Av13a 番茄植株研究植物抗晚疫病机理
• 3.5 结论
• 第四章 侧翼序列扩增筛选纯合MM-R3a-Av13a 植株
• 4.1 前言
• 4.2 材料方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 R3a 基因侧翼序列的扩增
• 4.3.2 R3a 基因侧翼序列测序结果分析
• 4.3.3 R3a 基因侧翼序列与边界序列在转基因后代中的扩增
• 4.3.4 Av13a 基因插入位点侧翼序列扩增
• 4.3.5 Av13a 侧翼序列测序结果分析
• 4.3.6 Av13a 基因侧翼序列与边界序列扩增
• 4.3.7 侧翼序列扩增在后代群体中的验证
• 4.3.8 诱导剂DEX 处理MM-R3a-Av13a 纯合株系
• 4.4 讨论
• 4.4.1 连接接头的PCR 方法是扩增侧翼侧翼未知序列的有效方法
• 4.4.2 利用 R3a 和Av13a 侧翼序列筛选纯合MM-R3a-Av13a 植株
• 4.4.3 MM-R3a-Av13a 纯合植株构建突变体库和突变体筛选方法确定
• 4.5 结论
• 第五章 马铃薯抗晚疫病基因在番茄中的应用研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 T1 代R3a 转基因番茄PCR 及接种结果
• 5.3.2 番茄晚疫病菌株中Av13a 等位基因的分析
• 5.3.3 转基因番茄接种马铃薯晚疫病菌株结果
• 5.3.4 转基因番茄接种番茄晚疫病菌株
• 5.4 讨论
• 5.4.1 R3a 基因可稳定遗传
• 5.4.2 晚疫病菌中Av13a 基因的分析有利于指导R3a 的应用
• 5.4.3 马铃薯抗晚疫病基因RB 可应用于番茄抗晚疫病育种
• 5.5 结论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介