不对称还原产l-麻黄碱重组大肠杆菌的构建

论文摘要

近年来,用手性技术不对称催化合成手性化合物及其手性中间体已经引起了学术界和企业界的重视,成为研究开发的热点。利用微生物酶进行不对称催化反应,具有反应条件温和、转化率高及立体选择性好等优点,已成为诸多手性合成方法的首选。本文以生物催化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮（MAK）生产麻黄碱为模型,利用基因工程技术手段构建重组大肠杆菌表达单一羰基还原酶,考察该重组菌催化底物MAK不对称还原为l-麻黄碱的反应特性。本文以重组质粒pET28a-mldh为模板,通过PCR扩增得到目的基因mldh,构建了重组大肠杆菌E.coli JM109 （pKK223-mldh）。利用表达产物进行生物转化,发现其具有催化底物MAK生成l-麻黄碱的能力。与重组大肠杆菌E.coli BL21 （pET28a-mldh）相比较,比酶活力提高了近3倍。对其进行IPTG诱导条件优化后,重组大肠杆菌E.coli JM109 （pKK223-mldh）在37℃,200 r/min条件下过夜培养后,按1 %接种量转接,相同条件培养至对数生长中后期,约4 h,用终浓度为0.4 mmol/L的IPTG诱导6 h,比酶活可达到0.56 U/mg蛋白。为了解决辅酶再生的问题,从枯草芽孢杆菌中克隆到葡萄糖脱氢酶基因gdh,构建了表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌E.coli BL21 （pET28a-gdh）作为还原型辅酶NADH的再生系统。并将重组质粒pKK223-mldh和pET28a-gdh共转化到大肠杆菌中,对重组菌的质粒稳定性分析发现,采用100 mg/L氨苄青霉素和30 mg/L卡那霉素作为起始浓度,在14 h内,两种质粒可以共存。重组菌经IPTG诱导后,利用表达产物进行不对称还原反应。结果表明,羰基还原酶基因mldh和葡萄糖脱氢酶基因gdh能够在重组大肠杆菌中同时表达,而且,在不额外添加葡萄糖脱氢酶及辅酶的情况下,重组大肠杆菌所表达的葡萄糖脱氢酶能够实现辅酶再生,催化整个不对称还原反应的进行。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 麻黄碱概述
• 1.1.1 麻黄碱简介
• 1.1.2 麻黄碱作用
• 1.2 麻黄碱的生产
• 1.2.1 植物提取法
• 1.2.2 化学合成法
• 1.2.3 植物细胞组织培养麻黄碱
• 1.2.4 半生物转化法生产麻黄碱
• 1.3 手性化合物简介及研究现状
• 1.3.1 手性化合物简介
• 1.3.2 手性化合物研究现状
• 1.4 手性化合物制备方法
• 1.4.1 物理法
• 1.4.2 化学法
• 1.4.3 生物合成与转化
• 1.5 生物催化
• 1.5.1 生物催化羰基还原反应原理
• 1.5.2 与化学方法的比较
• 1.5.3 纯化酶与全细胞生物催化的比较
• 1.6 羰基不对称还原酶的应用
• 1.7 研究意义
• 1.8 研究内容
• 第二章 羰基不对称还原酶基因的克隆与表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要生化和分子生物学试剂
• 2.1.4 主要仪器和设备
• 2.1.5 引物设计
• 2.1.6 质粒的大量提取
• 2.1.7 PCR 反应
• 2.1.8 PCR 产物的纯化
• 2.1.9 琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.10 大肠杆菌E.coli JM109 感受态的制备及简易转化程序
• 2.1.11 常规基因克隆操作方法
• 2.1.12 重组表达载体pKK223-mldh 的构建
• 2.1.13 蛋白质含量的测定
• 2.1.14 细胞裂解液的制备
• 2.1.15 酶活测定方法
• 2.1.16 重组质粒pKK223-mldh 表达产物的鉴定
• 2.1.17 重组菌生长曲线的测定
• 2.1.18 重组质粒pKK223-mldh 稳定性分析
• 2.1.19 IPTG 诱导条件的研究
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 目的基因mldh 的扩增
• 2.2.2 重组质粒pKK223-mldh 的构建
• 2.2.3 重组质粒稳定性分析
• 2.2.4 重组菌表达产物的鉴定
• 2.2.5 重组菌生长曲线的测定
• 2.2.6 重组菌IPTG 诱导条件的研究
• 2.2.7 SDS-PAGE 蛋白电泳分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 葡萄糖脱氢酶的克隆与表达
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要生化和分子生物学试剂
• 3.1.4 主要仪器和设备
• 3.1.5 引物设计
• 3.1.6 枯草芽孢杆菌总DNA 的提取
• 3.1.7 PCR 反应
• 3.1.8 PCR 产物纯化
• 3.1.9 琼脂糖凝胶电泳
• 3.1.10 重组表达载体的构建
• 3.1.11 蛋白含量测定
• 3.1.12 细胞裂解液的制备
• 3.1.13 酶活测定方法
• 3.1.14 生长曲线的测定
• 3.1.15 SDS-PAGE 蛋白电泳
• 3.1.16 重组质粒pET28a-gdh 稳定性分析
• 3.1.17 重组菌E.coli BL21（pET28a-gdh）在生物催化不对称反应中的应用
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 目的基因gdh 的扩增
• 3.2.2 重组质粒pET28a-gdh 的构建
• 3.2.3 重组质粒稳定性分析
• 3.2.4 重组菌生长曲线的测定
• 3.2.5 葡萄糖脱氢酶酶活测定
• 3.2.6 SDS-PAGE 蛋白电泳分析
• 3.2.7 重组菌E.coli BL21 （pET28a-gdh）在生物催化不对称反应中的应用
• 3.3 本章小结
• 第四章 共表达重组大肠杆菌产麻黄碱的研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要生化和分子生物学试剂
• 4.1.4 主要仪器和设备
• 4.1.5 重组大肠杆菌E.coli JM109 （pKK223-mldh，pET28a-gdh）和E.coli BL21（pKK223-mldh，pET28a-gdh）的构建
• 4.1.6 重组菌生长曲线的测定
• 4.1.7 培养时间对质粒共存的影响
• 4.1.8 辅酶对重组菌不对称还原反应的影响
• 4.1.9 羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶酶活测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 共表达重组大肠杆菌的构建
• 4.2.2 培养时间对质粒共存的影响
• 4.2.3 重组菌生长曲线测定
• 4.2.4 辅酶对重组菌不对称还原反应的影响
• 4.2.5 重组大肠杆菌在生物催化产l-麻黄碱中的应用
• 4.3 讨论
• 主要结论和展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文