论文摘要
目的:通过自身材料学因素控制和优化设计,赋予材料诱导组织再生的功能,已成为生物材料的研究热点之一。本研究首先通过壳聚糖（CS）磷酸化改性和在CS基质中添加钙磷盐,调控磷灰石晶体的形成与组装,探讨材料对骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖和分化的影响;其次改变CS表面微观物理形貌,探讨材料拓扑结构对MSCs黏附生长的影响。为制备具有良好生物相容性及骨诱导性的生物可降解膜材奠定理论基础。方法:（1）采用差速贴壁法分离、培养MSCs,观察其生物学特性;流式细胞技术和定向诱导分化法鉴定MSCs。（2）激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）和原子力显微镜（AFM）观察MSCs在成骨诱导前后的变化。（3）制备亚甲基磷酸化壳聚糖（NMPC）,与CS共混成膜并进行表征;与MSCs体外复合培养评价其生物相容性,实时荧光定量PCR（FQ-PCR）评价材料成骨诱导功能。（4）共沉淀法制备磷酸四钙（TTCP）、高温脱水法制备磷酸氢钙（DCPA）,与CS共混成膜并进行表征;与MSCs体外复合培养检测其生物相容性,通过检测碱性磷酸酶（ALPase）活性和成骨相关基因表达评价其成骨诱导性。（5）利用相变法制备高分子聚苯乙烯（PS）多孔膜,以此为模板制备不同表面微观结构的CS膜,评价表面微观结构对MSCs黏附、生长的影响。结果:（1）体外培养MSCs成纤维样、漩涡状生长,纯度随传代次数增加而提高;P3代MSCs表面抗原CD29、CD44表达阳性,CD45表达阴性;MSCs经定向诱导可分化为成骨细胞和脂肪细胞。（2）经成骨诱导后,MSCs胞内Ca2+由均匀分布转变为点状、块状的高Ca2+分布;胞质周围的微管荧光染色强度明显高于胞质中央,且排列稀疏而紊乱;细胞由长梭形转变为不规则状,细胞边缘网丝状伪足样突起减少,胞核增大,内有3-5个核仁,细胞膜表面粗糙,呈矿化物沉积特征。（3）CS与NMPC共混成膜制得CS/NMPC,与CS相比,表面接触角由77±2°降至的20±10°,吸水率由128±14%升至248±24.6%,拉伸强度和断裂伸长降低,弹性模量升高,材料能吸附培养基中的Ca2+;CS/NMPC更有利于细胞增殖,第5、7、9天差异显著（P＜0.05）;骨钙素（OC）、骨桥蛋白（OPN）为CS膜上的275.1%和736.2%,表明NMPC能诱导MSCs向成骨分化。（4）TTCP和DCPA与CS溶液共混后成膜,获得CS基羟基磷灰石（CS/HA）膜,其表面接触角为57±5°,吸水率185±15%,拉伸强度、断裂伸长、弹性模量较纯CS膜降低,对培养基中Ca2+吸附加速;与CS膜相比,CS/HA膜细胞生物相容性大幅提高,细胞增殖在第5、7天有显著差异（P＜0.05）,第9天有极显著差异（P＜0.01）;在成骨诱导培养12d后CS/HA膜上ALPase活性是CS膜的6.3倍,Ⅰ-型胶原（ColⅠ）、ALPase和OPN基因表达水平为CS膜的479.0%、377.1%和597.9%,表明CS/HA中的HA能显著诱导MSCs向成骨分化。（5）利用相分离技术制备不同孔洞PS膜,以此为模板制备微观结构完全匹配的CS膜,并在表面培养MSCs,结果表明CS膜上不同凸起对细胞黏附无显著差异;但凸起10-50μm不规则微球表面增殖率最高,其次为10μm规则紧密排列的半球状凸起,0.8-1μm短柱状凸起和光滑CS膜增值率最低。结论:材料化学组成及微观结构对MSCs的黏附、生长、分化均有影响。在以CS为基质的材料中添加含磷酸根的有机物NMPC和无机物HA,均增加细胞的生物相容性,并能诱导MSCs向成骨分化,是一种良好的具有骨诱导性能的组织工程材料;CS表面10-50μm微球结构CS膜能促进MSCs在材料上增殖,为下一步研究CS膜的不同拓扑结构对MSCs分化的影响奠定基础。
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