棉花叶绿体转化载体的构建以及转化体系的建立

论文摘要

通过细胞核遗传工程的研究,对棉花产量提高和品质改进以及抗病虫害起到了积极作用,但细胞核遗传工程仍存在诸如基因失活、基因沉默、位置效应、花粉漂移及多基因转化困难等弊端,而叶绿体转化技术作为一种新兴的遗传转化技术有望克服核基因转化带来的诸多不足,该技术的成功应用将会给棉花基因工程带来一次新的革命。为了解决棉花细胞核遗传工程所带来的诸多问题,我们开展了棉花叶绿体转基因的研究,构建棉花叶绿体转化载体;尝试建立棉花叶绿体转化的标准程序。根据已发表的棉花叶绿体基因组序列（NC007944）设计引物,用PCR方法扩增获得两段同源序列LHRR和RHRR,并通过酶切连接与质粒pBluesript SK连接构建出载体pBSKRR;同时用PCR方法扩增报告基因gfp及筛选标记nptⅡ基因,并在这两个基因两端分别加上来自于棉花叶绿体基因组的强启动子Prrn和PpsbA以及起稳定作用的3’UTR茎环结构Trps16和TpsbA,构建出含有Prrn—gfp—Trps16和PpsbA—nptⅡ—TpsbA表达盒的载体pGGPT和pGNPT;再将这两个基因表达盒与载体pBSKRR酶切连接构建出载体pBRGN,并初步应用于棉花和烟草的叶绿体转化,获得了具有卡那霉素抗性的烟草的绿色愈伤及幼苗,PCR检测出gfp基因和nptⅡ基因的条带,并在荧光显微镜下检测到gfp的表达。gfp在棉花胚性愈伤中也有少量表达,但表达情况很不理想,需要对转化受体以及再生条件进行进一步的摸索。尽管叶绿体转化在棉花中还存在着很多问题,但该实验结果证实了这一实验思路的可行性,为后期棉花叶绿体转化工作的顺利进行打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 1 文献综述
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 棉花转基因目前存在的问题
• 1.1.2 棉花叶绿体转化的可行性
• 1.2 植物叶绿体转化概述
• 1.2.1 叶绿体转基因技术的建立与发展
• 1.2.2 叶绿体转化系统的原理、方法与特点
• 1.2.3 叶绿体转基因技术的应用
• 1.3 原核表达在植物基因研究中的应用
• 1.4 本研究的意义和技术路线
• 1.4.1 项目研究的意义和必要性
• 1.4.2 本研究的技术路线
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株、质粒及各种分子生物学试剂
• 2.1.3 培养条件及其不同培养基配方
• 2.1.4 缓冲液配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 棉花和烟草基因组的提取
• 2.2.2 PCR扩增
• 2.2.3 载体构建
• 2.2.4 载体检测
• 2.2.5 原核表达（参照Novagen公司的pET system Manual）
• 2.2.6 基因枪转化棉花下胚轴及胚性、非胚性愈伤,烟草叶片
• 2.2.7 转化材料的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 棉花叶绿体同源片段,启动子（Prrn、PpsbA）,终止子（Trps16、TpsbA）片段的克隆及序列分析
• 3.2 叶绿体转化载体的构建
• 3.2.1 同源片段的连接
• 3.2.2 nptll基因表达盒的构建与连接
• 3.2.3 gfp基因表达盒的构建与连接
• 3.2.4 gfp基因表达盒、nptll基因表达盒与同源片段的连接
• 3.3 叶绿体转化载体的原核表达分析
• 3.3.1 表达载体的构建
• 3.3.2 诱导表达后gfp的检测
• 3.4 基因枪转化烟草和棉花及转化烟草的筛选和再生
• 3.4.1 棉花基因枪转化
• 3.4.2 烟草基因枪转化
• 3.5 转基因烟草叶片的gfp荧光检测及烟草叶片和棉花愈伤的PCR检测
• 3.5.1 转基因烟草叶片的gfp荧光检测
• 3.5.2 转基因烟草以及棉花愈伤的PCR检测
• 4.讨论
• 4.1 叶绿体转化载体的构建中的问题
• 4.2 叶绿体转化的方法
• 4.3 叶绿体转基因的同质化
• 4.4 叶绿体转基因植株的分子检测
• 参考文献
• 致谢