广藿香无菌苗的秋水仙素和EMS诱变及突变体植株遗传多样性的ISSR分析

论文摘要

广藿香（Pogostemon cablin）是我国重要常用中药之一；原产于菲律宾、马来西亚和印度等国家,后传入我国。广藿香在我国产区栽培,由于气温比原产地低,罕见开花,因此生产上一直采用扦插繁殖。在长期栽培过程中,病原体通过无性繁殖传递,故造成品种退化,病虫危害加重。为了确保广藿香这一重要中药种类的生存和发展,解决问题的措施之一是引入新的育种技术和方法以尽快培育出新品种。本研究以广藿香的无菌丛生芽为实验材料,使用秋水仙素和EMS进行诱变处理,并对突变体植株材料的遗传多样性,以及外植体材料的原初供体与突变体植株相互之间的遗传变异进行ISSR分析。本研究的主要实验结果如下：1.以广藿香幼嫩叶片为外植体,通过愈伤组织诱导途经得到大量丛生芽。将从生芽转接到含有不同浓度6-BA的增殖培养基和不同浓度IBA的生根培养基中,分别筛选出最适增殖培养基为：MS+0.1 mg/L～0.2 mg/L6-BA,最适生根培养基为1/2 MS+0.25 mg/L～1.0 mg/L IBA。以在MS+0.1 mg/L 6-BA培养基增殖的丛生芽为实验材料,用不同浓度化学诱变剂秋水仙素和甲基磺酸乙酯（EMS）处理不同时间,最终得到出广藿香从生芽的半致死剂量分别为：0.2%秋水仙素处理3d；以EMS为化学诱变剂时,半致死剂量为1.2%EMS处理7.5 h。2.为了建立沈广藿香ISSR-PCR的优化反应体系,本研究首先通过单因素试验选定其各影响因子比较适宜的浓度范围,再利用正交试验设计的方法,对影响广藿香ISSR-PCR反应的5种因素4水平进行优化试验。广藿香ISSR-PCR的优化反应体系最终确定为：在25μL反应体系中,DNA模板40 ng, Mg2+2.5mmol/L,引物浓度为0.3μmol/L, Taq聚合酶浓度为1.5 U, dNTPs浓度为150μmol/L。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min,然后按94℃变性45 s,50.9～58.1℃退火45 s,72℃延伸90 s,进行40个循环,最后72℃延伸7 min；4℃保存。利用优化后的反应体系和PCR扩增程序,根据所购引物的理论退火温度,设计了6个退火温度梯度对所购60个引物进行退火温度筛选,最终筛选出12个条带丰富、清晰且稳定的引物并确定了其最适退火温度。3.使用广藿香丛生芽的秋水仙素和EMS半致死剂量分别处理100多个丛生芽,最终获得71份秋水仙素诱变植株和62份EMS诱变植株,然后使用筛选出的12条ISSR有效引物分别对两类不同类型的诱变材料和一份原始供体植株材料（CK）进行ISSR扩增,并对诱变后植株的表形进行观察。结果发现：秋水仙素诱变后的植株矮化粗壮,分枝有所增多,但是通过ISSR遗传多样性分析表明诱变后植株遗传相似系数较大,遗传距离较小；EMS诱变后的植株大部分未发生表形变异,只有个别诱变植株的叶片形状、颜色等发生变化。经ISSR遗传多样性分析表明,相比秋水仙素诱变植株,EMS诱变植株遗传相似系数相对较小,遗传距离较大。这说明经EMS诱变的材料在DNA分子水平上发生了较大的变异。作者认为,这一现象可能与EMS多引起突变多为点突变,而秋水仙素所引起的突变则多数是由于染色体倍性的改变的遗传之变异机理有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 上篇 文献综述
• 1 广藿香种质资源研究进展
• 1.1 道地性研究
• 1.1.1 性状和显微鉴别
• 1.1.2 分子鉴别
• 1.1.3 指纹图谱鉴别
• 1.2 组织培养与快速繁殖
• 1.3 药理作用研究
• 1.3.1 调节胃肠道功能
• 1.3.2 抗病原微生物作用
• 1.3.3 抗疟原虫作用
• 1.3.4 其他作用
• 1.4 广藿香挥发油
• 1.4.1 挥发油的提取
• 1.4.2 挥发油成分影响因素
• 1.4.3 广藿香挥发油的分布
• 2 诱变技术在植物育种中的应用
• 2.1 秋水仙素在植物诱变育种的应用
• 2.1.1 秋水仙素化学诱变作用机理
• 2.1.2 诱导材料的选取
• 2.1.2.1 愈伤组织
• 2.1.2.2 从生芽
• 2.1.2.3 种子
• 2.1.2.4 叶片
• 2.1.2.5 茎尖
• 2.1.2.6 其他诱导材料
• 2.1.3 诱导方法
• 2.1.3.1 滴液法
• 2.1.3.2 琼脂法
• 2.1.3.3 浸渍法和混培法
• 2.1.4 影响染色体加倍的因素
• 2.1.4.1 秋水仙素处理浓度与处理时间
• 2.1.4.2 温度
• 2.2 EMS化学诱变作用机理
• 2.2.1 EMS诱变的剂量
• 2.2.2 EMS诱变的材料
• 2.2.2.1 EMS处理种子
• 2.2.2.2 其它材料
• 2.2.3 EMS诱变与离体培养结合
• 3 分子标记技术
• 3.1 分子标记技术的基本概念与优点
• 3.2 DNA分子标记技术的归类
• 3.2.1 基于Southern杂交的分子标记技术
• 3.2.2 基于PCR的分子标记技术
• 3.2.3 ISSR分子标记及其特点
• 3.3 ISSR分子标记在植物遗传多样性及亲缘关系分析上的应用
• 4 本研究的目的和意义
• 5 技术路线
• 下篇 广藿香无菌苗的秋水仙素和EMS诱变及突变体植株遗传多样性的ISSR分析
• 1 广藿香无菌材料的构建、无菌苗组培快繁与移栽技术
• 1.1 材料与办法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 主要化学试剂
• 1.1.3 组织培养主要仪器设备
• 1.1.4 培养基配方
• 1.1.4.1 愈伤组织诱导培养基
• 1.1.4.2 丛生芽诱导培养基
• 1.1.4.3 丛生芽增殖培养基的基本成分
• 1.1.4.4 丛生芽生根培养基的基本成分
• 1.1.5 实验方法
• 1.1.5.1 无菌材料的建立
• 1.1.5.2 广藿香丛生芽最适增殖培养基的筛选
• 1.1.5.3 广藿香丛生芽最适生根培养基的筛选
• 1.1.5.4 广藿香组培苗的移栽
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 无菌材料的建立与增殖结果
• 1.2.2 不同6-BA浓度对广藿香丛生芽增殖与生长发育的影响
• 1.2.3 不同IBA浓度对广藿香无菌苗生根和植株生长发育的影响
• 1.2.4 广藿香组培苗移栽成活情况
• 1.3 结论
• 2 广藿香丛生芽秋水仙素半致死剂量的测定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 实验方法
• 2.1.4.1 培养基的配制与灭菌条件
• 2.1.4.2 秋水仙素处理广藿香丛生芽
• 2.1.4.3 培养条件
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同浓度秋水仙素不同处理时间对广藿香丛生芽存活率的影响
• 2.2.2 秋水仙素处理后对广藿香植株表形性状的影响
• 3 广藿香丛生芽EMS半致死剂量的测定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 实验方法
• 3.1.4.1 培养基的配制与灭菌条件
• 3.1.4.2 试剂配制
• 3.1.4.3 EMS处理广藿香丛生芽
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不同浓度EMS和不同处理时间对广藿香植株生根时间和生根率的影响
• 3.2.2 广藿香丛生芽半致死剂量的确定
• 3.2.3 EMS处理对广藿香植株性状的影响
• 4 利用单因子和正交设计双重实验方法优化广藿香ISSR-PCR实验体系
• 4.1 材判与办法
• 4.1.1 供试材料
• 4.1.2 试剂及其配制
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.1.4 实验方法
• 4.1.4.1 广藿香DNA的提取
• 4.1.4.2 单因子试验
• 4.1.4.3 ISSR-PCR反应因素水平的正交设计
• 4.1.4.4 两种优化体系的比较
• 4.1.4.5 退火温度和循环次数的确定
• 4.1.4.6 不同引物退火温度的确定及其筛选
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 广藿香DNA提取
• 4.2.2 单因子试验结果分析
• 4.2.2.1 模板DNA用量对ISSR-PCR反应的影响
• 2+浓度对ISSR-PCR反应的的影响'>4.2.2.2 Mg²⁺浓度对ISSR-PCR反应的的影响
• 4.2.2.3 引物浓度对ISSR-PCR反应的影响
• 4.2.2.4 TaqDNA聚合酶的用量对ISSR-PCR反应的影响
• 4.2.2.5 dNTPs浓度对ISSR-PCR反应的影响
• 4.2.3 PCR正交设计直观分析
• 4.2.4 两种优化体系的比较
• 4.2.5 不同退火温度对广藿香ISSR-PCR扩增的影响
• 4.2.6 循环次数对广藿香ISSR-PCR扩增的影响
• 4.2.7 ISSR引物的筛选及最佳退火温度的确定
• 5 秋水仙素和EMS诱变后广藿香植株ISSR遗传多样性分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 仪器与试剂
• 5.1.3 方法
• 5.1.3.1 诱变后广藿香植株DNA的提取
• 5.1.3.2 诱变植株无菌苗的移栽与苗圃管理
• 5.1.3.3 PCR扩增反应
• 5.1.3.4 扩增产物的检测
• 5.1.3.5 诱变植株的ISSR遗传多样性分析
• 5.1.3.6 PCR扩增谱带的统计和分析
• 5.1.3.7 对诱变后的广藿香植株进行表形观察
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 DNA质量检测
• 5.2.2 秋水仙素索诱变植株ISSR-PCR遗传多样性分析
• 5.2.2.1 秋水仙素诱变植株ISSR扩增结果
• 5.2.2.2 秋水仙素诱变植株ISSR遗传多样性分析
• 5.2.2.3 秋水仙素诱变后植株表形观察
• 5.2.3 EMS诱变植株ISSR-PCR遗传多样性分析
• 5.2.3.1 EMS诱变植株ISSR扩增结果
• 5.2.3.2 EMS诱变植株ISSR遗传多样性分析
• 5.2.3.3 EMS诱变后植株表形观察
• 6 讨论
• 6.1 组织培养与人工诱变相结合培育新品种
• 6.2 不同植物不同器官对诱变剂的敏感性
• 6.3 关于诱变剂的种类及诱变效果
• 6.4 ISSR实验条件优化
• 6.5 关于ISSR分析的可靠性问题
• 6.6 关于广藿香诱变苗的嵌合体问题
• 7 结论
• 参考文献
• 致谢