短小芽孢杆菌fadD基因的敲除及其对ω-1-羟基脂肪酸产量的影响

论文摘要

C18长碳链羟基脂肪酸中的ω-1、ω-2、ω-3-羟基脂肪酸(ω-1、ω-2、ω-3-HFA)可应用于机械工业、食品工业;而作为单体合成高分子聚合物时可提供最长的单体分子碳链,使得聚合物材料无单分子侧链,性能更优越,是当今绿色聚合物材料研究开发中最理想的单体成分之一。短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）M-F641是一株经过诱变后获得的ω-1-羟基脂肪酸高产菌株,该菌株易于培养,且ω-1-羟基脂肪酸转化率高（16.8%）,为了能够进一步提高羟基脂肪酸的转化率（羟基脂肪酸与脂肪酸加入总量之比）和羟基脂肪酸产率（羟基脂肪酸与脂肪酸消耗量之比）,本文对脂肪酸β-氧化代谢过程中参与长链脂肪酸活化、跨膜转运和编码脂酰CoA合成酶（Fatty acyl coenzyme A synthetases,FACS）的关键酶基因fadD进行了研究,主要研究内容如下:首先,根据已发表的短小芽孢杆菌以及芽孢杆菌属的其它菌株的fadD基因设计了特异性引物,PCR扩增获得了B. pumilus M-F641的fadD基因序列,长度为1720bp,并利用MEGA 3.1、DNAStar软件对该基因序列进行了分析。其次,构建重组表达质粒pET32M- fadD,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达,IPTG诱导后表达产物经SDS-PAGE电泳分析表明重组质粒在约65 kDa处有明显的表达,并利用试剂盒测定了表达产物脂酰CoA合成酶的活性,酶活达到79.2U/mg。最后,确定基因敲除策略,成功构建了自杀载体pMD18-T-fadD::Tetr,通过插入失活的方法对B. pumilus M-F641的fadD基因进行敲除,获得其fadD基因缺陷菌株B. pumilus M-F641A,经24h简单发酵验证,缺陷菌株B. pumilus M-F641A的ω-1羟基脂肪酸的产率为16.95%,但并不能证明产率有所提高,需经进一步发酵验证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 绪论
• 1.1 羟基脂肪酸概述
• 1.2 羟基脂肪酸的主要生产途径
• 1.2.1 化学合成途径
• 1.2.2 生物合成途径
• 1.3 合成羟基脂肪酸的微生物
• 1.4 脂肪酸羟基化反应的作用机制及基因工程的应用
• 1.5 微生物的细胞色素P-450
• 1.5.1 微生物细胞色素P-450 的分布
• 1.5.2 P-450 的催化机制
• 1.6 脂肪酸的氧化代谢
• 1.6.1 脂肪酸的活化
• 1.6.2 脂酰辅酶A 进入线粒体
• 1.6.3 β-氧化反应过程
• 1.6.4 脂肪酸β-氧化过程中的基因调控
• 1.6.5 脂肪酸的其它氧化形式
• 1.7 基因敲除技术
• 1.7.1 基因敲除原理
• 1.7.2 微生物基因敲除系统
• 1.7.3 原核生物基因敲除策略
• 1.7.4 基因敲除技术在菌种改良中的应用
• 1.8 研究依据、目的和内容
• 2 脂肪酸Bacillus pumilus 羟基化调控基因fadD 的克隆与序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 形态与生理生化鉴定
• 2.1.6 PCR 引物
• 2.1.7 短小芽孢杆菌总DNA 的提取
• 2.1.8 PCR 扩增165 rDNA
• 2.1.9 连接
• 2.1.10 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.11 转化
• 2.1.12 165 rRNA 的测序及同源性比较
• 2.1.13 PCR 扩增fadD 基因
• 2.1.14 fadD 基因的序列分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 菌株形态特征
• 2.2.2 菌株生理生化鉴定
• 2.2.3 菌株的165 rDNA 序列分析鉴定
• 2.2.4 PCR 扩增fadD 基因结果
• 2.2.5 短小芽孢杆菌fadD 基因及其编码氨基酸序列分析
• 2.2.6 脂酰辅酶A 合成酶系统进化分析
• 2.3 本章小结
• 3 脂酰辅酶A 合成酶基因在大肠杆菌中的表达及酶活测定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 PCR 扩增引物
• 3.1.6 溶液和缓冲液
• 3.1.7 带有特异酶切位点的fadD 基因的克隆
• 3.1.8 小量质粒的提取
• 3.1.9 酶切
• 3.1.10 连接
• 3.1.11 E.Coli BL21 感受态细胞的制备、转化及重组子的筛选
• 3.1.12 fadD 基因在E.Coli BL21 中的诱导表达
• 3.1.13 原核表达蛋白样品的准备
• 3.1.14 原核表达蛋白质浓度的测定
• 3.1.15 脂酰辅酶A 合成酶酶活测定
• 3.1.16 酶活的计算
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 PCR 扩增结果
• 3.2.2 重组质粒pET32M-fadD 的构建
• 3.2.3 融合基因在E.coli BL21 的表达
• 3.2.4 蛋白浓度测定结果
• 3.2.5 脂酰辅酶A 合成酶酶活
• 3.3 本章小结
• 4 Bacillus pumilus M-F641 fadD 基因的敲除及简单发酵验证
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株与质粒
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 PCR 扩增引物
• 4.1.6 fadD 基因敲除策略
• 4.1.7 重组质粒pMD18-T-fadD 的构建
• 4.1.8 重组质粒pMD18-T- fadD::Tetr的构建
• 4.1.9 B. pumilus M-F641 原生质体的制备与转化
• 4.1.10 转化子的筛选
• 4.1.11 发酵液的萃取
• 4.1.12 样品的甲酯化
• 4.1.13 羟基脂肪酸含量测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 重组质粒pMD18-T-fadD 的构建
• r）的PCR 扩增'>4.2.2 四环素抗性基因（Tet^r）的PCR 扩增
• 4.2.3 自杀载体pMD18-T-fadD:: Tetr的构建
• 4.2.4 B. pumilus M-F641 菌株fadD 基因的敲除及转化子筛选
• 4.2.5 发酵产物的GC 分析
• 4.3 本章小结
• 5 结论和建议
• 5.1 实验结论
• 5.2 存在的问题与不足
• 5.3 进一步研究的建议
• 参考文献
• 在学研究成果
• 致谢