广州管圆线虫cDNA文库的构建分析及广州管圆线虫病疗效考核抗原的筛选鉴定

论文摘要

广州管圆线虫病(Angiostrongyliasis)是由广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)感染而引起的。作为一种新发的食源性传染性疾病，广州管圆线虫病在全球的流行都呈现出上升的趋势，对人类的威胁也越来越大。广州管圆线虫主要侵犯中枢神经系统，引起嗜中性粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎。感染该病后，绝大多数患者有头痛、肌肉痛、恶心、呕吐、感觉异常、触摸痛、发热、畏光、视力模糊、嗜睡、颈硬等症状。其中以头痛最突出，患者自诉“头痛欲裂”或忍受不了；全身疼痛、皮肤过敏的现象也比较严重；个别病人还会出现精神病样症状。我国是广州管圆线虫病的主要流行区之一，近几年的发病数逐渐增多，甚至出现了爆发流行。如何有效地防治广州管圆线虫病已成为亟待解决的重要问题。 在广州管圆线虫病的防治工作中，诊断是关键。诊断明确，治疗及时，则病人的转归一般良好。但目前国内外都还缺乏敏感特异、能产业化生产、标准化的诊断试剂盒。针对目前这个难点问题，本论文进行了以下研究：一、广州管圆线虫幼虫cDNA文库的构建与幼虫、成虫基因表达模式分析 鉴于广州管圆线虫在人体的感染和致病阶段主要为幼虫，本文构建了广州管圆线虫脑期幼虫的cDNA文库，并用EST(expressed sequence tag)方法对其基因表达谱和成虫的基因表达谱进行了初步分析，目的是对此新发传染病病原的分子生物学特征进行了解和为诊断性抗原的筛选提供库源。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写
• 前言
• 第一章 广州管圆线虫幼虫cDNA文库的构建与幼虫、成虫基因表达模式分析
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株及质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 溶液及培养基配制
• 1.1.4 主要实验仪器
• 1.1.5 实验动物
• 1.1.6 广州管圆线虫感染大鼠血清
• 1.2 方法
• 1.2.1 广州管圆线虫幼虫cDNA文库的建立
• 1.2.2 广州管圆线虫成虫表达模式的分析
• 1.3 结果
• 1.3.1 广州管圆线虫总RNA的质和量
• 1.3.2 所建文库的特性
• 1.3.3 广州管圆线虫幼虫和成虫cDNA文库表达谱的分析
• 1.4 讨论
• 1.4.1 广州管圆线虫幼虫cDNA文库的评价
• 1.4.2 GenBank中广州管圆线虫基因的数据情况
• 附表1. 91个广州管圆线虫幼虫EST序列的BLAST分析
• 附表2. 54个广州管圆线虫成虫EST序列的BLAST分析
• 第二章 广州管圆线虫新基因的发现
• 2.1 材料
• 2.1.1 细菌菌株及质粒
• 2.1.2 文库
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 全长基因和发现和鉴定
• 2.2.1.1 G40、G172克隆全长cDNA的序列测定
• 2.2.1.2 对全长ORF序列进行蛋白质功能预测
• 2.2.1.3 G40、G172全长cds cDNA序列登录GenBank
• 2.2.2 目标基因的克隆、表达、鉴定、纯化及免疫反应性的评价
• 2.2.2.1 表达质粒的构建
• 2.2.2.2 目标基因的表达
• 2.2.2.3 目标蛋白的鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 G40克隆
• 2.3.1.1 G40基因序列所编码的蛋白质分析
• 2.3.1.2 G40基因同源性搜索结果
• 2.3.1.3 利用CD-Search程序对G40蛋白进行保守区域的搜索结果
• 2.3.1.4 G4D基因在大肠杆菌中的表达及产物的鉴定结果
• 2.3.2 G172克隆
• 2.3.2.1 G172基因序列及氨基酸序列
• 2.3.3.2 G172基因同源性搜索结果
• 2.3.3.3 利用CD-Search程序对G40蛋白进行保守区域的搜索结果
• 2.4 讨论
• 第三章 广州管圆线虫病疗效考核大鼠模型的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 仪器、试剂、动物
• 3.1.2 动物分组
• 3.1.3 广州管圆线虫的人工感染
• 3.1.4 广州管圆线虫感染大鼠的药物治疗
• 3.1.5 大鼠血清的收集
• 3.1.6 感染大鼠的治疗效果观察
• 3.2 结果
• 3.2.1 大鼠的感染情况
• 3.2.2 大鼠的体内广州管圆线虫检获结果
• 3.3 讨论
• 第四章 广州管圆线虫病疗效考核抗原的筛选与鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 仪器试剂与动物
• 4.1.2 广州管圆线虫可溶性抗原的制备
• 4.1.3 治疗前后广州管圆线虫感染大鼠血清的制备
• 4.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 4.1.5 Western-blot
• 4.1.6 广州管圆线虫Mr 32 000抗原（AC32）的切胶纯化与鉴定
• 4.1.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 4.2 结果
• 4.2.1 Western blot结果
• 4.2.2 抗原纯化与活性鉴定结果
• 4.2.3 ELISA结果
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 附录1 表达序列标签注册用E-Mail通讯格式
• 附录2 EST序列整理
• 附录3 已登录的包含全长ORF的广州管圆线虫cDNA
• 博士生期间发表的与本研究相关的论文
• 致谢
• 原创性声明和版权使用授权书