论文题目: 利用转录因子OsiWRKY和OPBP1基因提高水稻抗病及耐盐性研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物病理与分子生物学
作者: 李南羿
导师: 郭泽健
关键词: 水稻,转基因,农杆菌,稻瘟病菌,白叶枯病菌,基因枪,抗病性,耐盐性
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 在长期的进化过程中,植物发展了一个十分复杂精密的基因表达调控体系来抵御逆境胁迫所造成的不良反应。这种基因表达调控主要是转录因子在转录水平上的调控,转录因子可以通过与相应的顺式作用元件结合,同时调控与同类抗逆性状有关的多个基因的表达,使植物作出适应逆境胁迫的代谢调整。ERF和WRKY都是在植物中发现,与逆境胁迫相关的一类转录因子。OsiWRKY是我们分离到的一个与水稻防卫反应相关的WRKY基因。OPBP1属于ERF类转录因子,是本实验室利用烟草渗调蛋白基因启动子中含有GCC盒的序列,用酵母单杂交方法获得的,在烟草中增强表达OPBP1能提高烟草的耐盐能力。本研究将OsiWRKY基因在水稻中增强表达,对所获得的转基因植株的抗病性以及OsiWRKY所参与调控的水稻抗病反应的分子机理进行了初步研究;同时还用基因枪介导的方法将OPBP1基因和OsiWRKY基因共转化入水稻,并对所获得的转基因植株的抗病性及耐盐性进行了检测。主要结果如下: 1.将OsiWRKY基因构建在植物双元表达载体pCamU的ubiquitin启动子下游,利用农杆菌介导法将OsiWRKY基因转入水稻,获得31个独立转化株系。经PCR检测,转基因植株阳性率90%以上。部分T1代植株Southern杂交结果表明,OsiWRKY基因以低拷贝(1-2个)整合到水稻基因组中。Northern杂交分析表明,OsiWRKY基因在T1代转基因植株中得到超量表达。对部分T1代种子进行了潮霉素抗性遗传分析,证明外源基因在转基因后代中发生了分离。抗病性测定表明,与未转基因对照相比,T1代增强表达转基因植株表现出对稻瘟病菌(Magnaporthe.grisea)和白叶枯病菌(Xanthomonas.oryzae pv.oryzae)较好的抗性,说明OsiWRKY基因在水稻中的增强表达使转基因植株具有广谱抗病性。 2.对本实验室所获得的OsiWRKY基因干涉转基因T1代植株和OsiWRKY基因增强表达T2代植株进行稻瘟病抗性检测。结果表明,干涉转基因植株和未转基因对照在病斑数目上均未有明显差异,而T2代增强表达转基因植株病斑数目明显
论文目录:
致谢
摘要
Abstract
第一部分 文献综述
第一章 植物转录因子研究进展
1.1 转录因子的结构和功能
1.1.1 DNA结合区
1.1.2 转录调控区
1.1.3 核定位信号区
1.1.4 寡聚化位点
1.2 转录因子的活性调节
1.3 转录因子功能分析方法
1.3.1 植物细胞瞬间表达分析
1.3.2 基因功能缺失方法
1.3.3 反义抑制(RNA antisense)
1.3.4 RNA干涉(RNA interference)
1.3.5 基因功能增强表达方法
1.4 与植物抗病途径相关的转录因子
1.4.1 MYB类转录因子
1.4.2 bZIP类转录因子
1.4.3 AP2／EPEBP类转录因子
1.4.4 WRKY转录因子
1.4.5 Whirly转录因子
1.5 植物抗病信号传导途径中的转录调控
1.5.1 植物抗病信号传导途径
1.5.2 植物防卫反应中的转录调控
1.6 立论依据及目的意义
第二部分 研究论文
第二章 OSIWRKY基因在水稻中增强表达及转基因水稻抗病性分析
2.1 材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 质粒与菌株
2.1.3 常用培养基、试剂和抗生素
2.2 方法
2.2.1 植物表达载体pCamU-Ubi-OsiW的构建
2.2.2 植物双元表达载体pCamU-Ubi-OsiW转入根癌农杆菌EHA105
2.2.3 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化
2.2.4 转基因植株的PCR检测
2.2.5 转基因植株的Southern blot检测
2.2.6 转基因植株的Northern blot检测
2.2.7 转基因T1代潮霉素抗性检测
2.2.8 转基因植株对稻瘟病的抗性鉴定
2.2.9 对白叶枯的抗性鉴定
2.3 结果与分析
2.3.1 OsiWRKY基因植物表达载体的构建
2.3.2 水稻的转化
2.3.3 转基因植株PCR检测
2.3.4 转基因植株的Southern blot分析.
2.3.5 转基因植株的Northern blot分析
2.3.6 潮霉素抗性遗传分析
2.3.7 转基因植株抗病性分析
2.4 讨论
第三章 OSIWRKY基因参与水稻抗病分子机理初探
3.1 材料
3.1.1 水稻
3.1.2 病原菌
3.2 方法
3.2.1 OsiWRKY基因RNA干涉T1代转基因植株Southern blot分析
3.2.2 OsiWRKY基因增强表达和干涉表达转基因水稻植株对稻瘟病菌的抗性鉴定
3.2.3 OsiWRKY基因增强表达和干涉表达转基因水稻植株水稻Northern blot分析
3.2.4 转基因T1代水稻PR基因的诱导表达
3.3 结果与分析
3.3.1 OsiWRKY基因RNA干涉T1代转基因植株Southern blot分析
3.3.2 OsiWRKY基因做为一种正调控因子参与水稻的抗病反应
3.3.3 PAL基因在增强和干涉转基因植株中的表达
3.3.4 PBZ1基因在增强和干涉转基因植株中的表达
3.4 讨论
第四章 转录因子OPBP1和OSIWRKY基因的超表达提高水稻的抗病及耐盐能力
4.1 材料
4.1.1 植物材料和菌株
4.1.2 植物表达载体
4.1.3 培养基
4.1.4 仪器及附件
4.2 方法
4.2.1 基因枪法转化水稻
4.2.2 转基因株系的分子生物学检测
4.2.3 转基因植株抗病性鉴定
4.2.4 转基因植株抗盐能力测定
4.3 结果与分析
4.3.1 转基因植株的获得
4.3.2 T0代转基因植株的PCR鉴定
4.3.3 T1代转基因植株分子生物学鉴定
4.3.4 转基因植株的抗病性检测
4.3.5 转基因植株抗盐能力显著增强
4.4 讨论
全文小结
参考文献
附录A 常用培养基、化学试剂和缓冲液配方
附录B 主要化学药品、分子生物学试剂及仪器
发布时间: 2005-07-22
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