大肠杆菌双顺反子表达载体中各基因表达水平的研究

论文摘要

从20世纪70年代初期基因克隆技术建立至今,短短几十年的时间,基因克隆技术发展十分迅猛,迄今已有很多外源基因被克隆到不同的表达载体中,进行各种研究,以期造福人类。但是,很多生物学功能并不是由一个基因或一种蛋白来控制和完成的,它需要多个相关基因或蛋白的共同作用。多基因共表达在许多领域都有着重要的应用价值和应用前景[1]。多顺反子表达是多基因共表达的一种方法。构建多顺反子表达载体,研究原核生物多顺反子不同间隔区对外源基因表达效率的影响,将对多基因共表达具有一定的指导意义。目前,原核生物间隔区对外源基因表达效率的定量分析尚无报导。本研究从大肠杆菌基因组序列出发,对其多顺反子间隔区多种形式和序列进行分析,选取融合表达、无间隔序列、起始密码子与终止密码子重迭序列TAATG、间隔序列为pET-32a中T7启动子后的核糖体结合序列（GAAGGAGATATACAT）和lacZ和lacY之间天然间隔区（TAATAACCGGGCAGGCCATGTCTGCCCGTATTTCGCGTAAGGAAATCCATT）加以研究。在大肠杆菌中构建以β-半乳糖苷酶（GAL）为担体蛋白,绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因的双顺反子表达载体pET28a-lacZ-gfpD（无间隔序列）,pET28a-lacZ-gfpL（间隔序列为起始密码子与终止密码子重迭序列）,pET28a-lacZ-gfpR（β-半乳糖苷酶与绿色荧光蛋白融合表达）,pET28a-lacZ-gfp15（间隔序列为pET-32a中T7启动子后的核糖体结合序列）及pET28a-lacZ-gfp51（间隔序列为lacZ和lacY之间天然间隔区）,同时构建对照质粒pET28a-gfp和pET28a-lacZ。将上述质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,加入IPTG进行诱导表达,利用荧光分光光度计对GFP的表达量进行荧光检测,并测定β-半乳糖苷酶的酶活力,最终用蛋白质电泳进行验证。结果显示,双顺反子表达载体中不同的间隔序列不仅对位于下游的顺反子gfp的表达水平有影响,对位于上游的顺反子lacZ的表达水平也有一定的影响。我们设计的这种双顺反子的表达规律是否适用于其他外源基因,还有待于更多的应用来证实,但至少对于双顺反子载体的构建提供了一个借鉴。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 大肠杆菌表达系统
• 1.1.1 pET 载体介绍及应用
• 1.1.2 克隆宿主菌和表达宿主菌
• 1.2 β-半乳糖苷酶（GAL）
• 1.2.1 β-半乳糖苷酶的来源和分类
• 1.2.2 β-半乳糖苷酶的性质和用途
• 1.2.3 lacZ 在大肠杆菌中的表达
• 1.3 绿色荧光蛋白
• 1.3.1 GFP 的来源、结构、性质及发光机制
• 1.3.2 GFP 的改进
• 1.3.3 应用现状
• 1.4 构建并利用双顺反子生产目的产物的研究
• 1.4.1 构建融合基因表达载体的研究
• 1.4.2 构建双顺反子表达载体的研究
• 1.5 本课题的研究目的及研究内容
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究内容
• 1.5.3 技术路线
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 PCR 反应引物
• 2.1.5 培养基及常用溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株的培养
• 2.2.2 E.coli 感受态细胞的制备
• 2.2.3 PCR 反应
• 2.2.4 酶切反应
• 2.2.5 连接反应
• 2.2.6 质粒及连接产物转化
• 2.2.7 阳性重组克隆的筛选与鉴定
• 2.2.8 电泳分析
• 2.2.9 目的条带的回收
• 2.2.10 E.coli 质粒的小量提取（SDS-碱裂解法）
• 2.2.11 菌体诱导培养
• 2.2.12 绿色荧光蛋白的测定
• 2.2.13 酶活测定
• 2.2.14 蛋白电泳验证
• 第三章 实验结果与讨论
• 3.1 质粒构建
• 3.1.1 pET28a-lacZ 的构建
• 3.1.2 pET28a-gfp 的构建
• 3.1.3 pET28a-lacZ-gfpD 质粒的构建
• 3.1.4 pET28a-lacZ-gfpL 的构建
• 3.1.5 pET28a-lacZ-gfpR 的构建
• 3.1.6 pET28a-lacZ-gfp15 的构建
• 3.1.7 pET28a-lacZ-gfp51 的构建
• 3.2 诱导表达及菌株评价
• 3.2.1 绿色荧光蛋白荧光强度的测定
• 3.2.2 β-半乳糖苷酶活力的测定
• 3.2.3 蛋白电泳验证
• 3.2.4 菌株评价分析
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 科研情况
• 致谢