论文摘要
研究背景支气管哮喘（简称哮喘）是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。全世界大约有3亿哮喘患者,所有哮喘患者包括儿童在内,都存在气道重塑,气道重塑的发生在临床症状出现之前就已经存在。主要表现为上皮下纤维化,包括气道平滑肌细胞增生和肥大、气道壁血管的增生,以及粘液分泌增加。引起哮喘患者气道重塑的原因尚不十分清楚。目前针对哮喘的治疗主要分为控制发作用药和急救用药,尚没有药物可以逆转哮喘患者的气道重塑。去整合素金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase,ADAM）33是最近发现的ADAM家族成员,定位于第20号染色体短臂13号位（20p13）,编码一种金属蛋白酶,可能参与气道的重塑。ADAM33是一个高度多态性的基因,含有70多个单核苷酸多肽位点。其中许多位点已经被证实与气道高反应性和哮喘有关。ADAM33主要在平滑肌细胞、成肌纤维细胞和成纤维细胞中表达,而在上皮细胞、T淋巴细胞或炎症细胞中表达较少。ADAM33在间充质细胞中的选择性表达,说明其活性改变可能会导致气道平滑肌细胞和成纤维细胞的功能异常,因此推测ADAM33可能与气道重塑有关。ADAM33在慢性哮喘模型中的作用,目前尚无相关报道。哮喘是一种以Th1/Th2细胞因子表达失衡为特点的气道变应性炎症性疾病,表现为Th2反应增强,Th1反应减弱。干扰素-γ（IFN-γ）是Th1型细胞因子,在哮喘的发病机制中起重要作用:主要表现为强烈抑制Th2细胞因子（IL-4,IL-13）的活性,调节Th1/Th2平衡;在哮喘患者的肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中,IFN-γ的水平明显低于正常人;IFN-γ可以明显减轻哮喘模型的气道高反应性。IFN-γ也参与了肺部疾病气道重塑。IFN-γ可以减轻病毒性细支气管炎导致的气道炎症、气道重塑和肺阻力及动态顺应性的改变;在博来霉素所致的肺纤维化小鼠模型中,IFN-γ可以明显抑制成纤维细胞的增生和胶原沉积;在特发性肺间质纤维化患者中,给予IFN-γ治疗可以降低TGF-β1和结缔组织生长因子基因的表达水平,从而提高患者的肺功能和血气水平。然而在慢性哮喘模型中,IFN-γ与气道重塑的关系报道甚少。在过敏源所致的急性哮喘模型中,针对一种或多种细胞因子,已经进行了大量的研究,并且取得了良好的效果。但是应用于临床后的结果却令人大失所望。试验与临床不一致的原因可能是由于,人类哮喘是一种慢性疾病,而动物模型是一种短期激发所导致的急性模型或者是基因敲除所致的某种细胞因子缺乏的模型。因此,若要评价一种干预方案是否可靠,必须建立与人类疾病更为相似的慢性气道疾病模型。本研究构建了小鼠慢性气道重塑哮喘模型,以重组小鼠IFN-γ（Recombinant murine IFN-γ,rm IFN-γ）和腺病毒载体介导小鼠IFN-γ（AdCMVmIFN-γ）干预,观察其在体内对ADAM33表达的及气道重塑的影响。在体外培养的小鼠成纤维细胞系中,给予rmIFN-γ和AdCMVmIFN-γ干预,观察其直接对ADAM33表达的调节作用;同时,为进一步研究ADAM33基因的功能,本实验还构建了ADAM33-短发卡RNA（Short hairpin RNA,shRNA）慢病毒质粒表达载体,成功敲低了成纤维细胞中ADAM33基因的表达,为下一步构建ADAM33基因敲低试验动物,进一步探索ADAM33基因在哮喘中的作用提供了有力的工具。第一章干扰素γ对小鼠哮喘模型去整合素金属蛋白酶33的调节作用目的探讨预防性和治疗性给予腺病毒载体介导转基因表达小鼠γ干扰素（AdCMVmIFN-γ）和重组mIFN-γ（rmIFN-γ）在卵蛋白所致小鼠气道重塑哮喘模型中对ADAM33表达及气道重塑的影响。方法C57BL/6小鼠于第0、14天以卵蛋白（Ovalbumin,OVA）腹腔注射致敏,从第24天开始雾化吸入2.5%的OVA激发并持续18天,建立气道重塑模型。分别预防性给予（抗原激发前一天）和治疗性给予（第一次抗原激发后18天）AdCMVmIFN-γ和rmIFN-γ。用半定量逆转录-聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹法检测ADAM33的表达,同时对肺组织切片行苏木精-依红（hematoxylin and eosi,HE）和Masson染色,测定气道平滑肌厚度和胶原面积。结果OVA致敏/激发的小鼠模型肺组织中呈明显以嗜酸性粒细胞为主的炎性浸润、平滑肌肥厚、胶原沉积和ADAM33高表达。预防性给予AdCMVmIFN-γ转基因表达mIFN-γ可明显改善上述变化。而在气道重塑形成后治疗性给予AdCMVmIFN-γ转基因表达mIFN-γ干预和rmIFN-γ可部分下调ADAM33表达和气道重塑发生。结论ADAM33在哮喘平滑肌肥厚和胶原沉积过程中可能起一定作用;腺病毒介导mIFN-γ气道内局部转基因表达的预防性干预可明显抑制ADAM33的表达,减轻气道重塑;气道重塑形成后的治疗性干预可部分下调ADAM33表达和减轻气道重塑。第二章干扰素γ对小鼠成纤维细胞中ADAM33的调节作用目的探讨IFN-γ在小鼠成纤维细胞系（NIH/3T3）中对ADAM33基因表达的影响。方法以不同浓度的腺病毒载体介导转基因表达小鼠γ干扰素（AdCMVmIFN-γ）和重组mIFN-γ（rmIFN-γ）在不同时间干预NIH/3T3细胞系,采用ELISA方法检测细胞培养液中mIFN-γ的含量,以RT-PCT和Western-Blot方法检测细胞中ADAM33mRNA和蛋白质的表达水平。结果AdCMVmIFN-γ转基因表达mIFN-γ和rmIFN-γ均呈浓度和时间依赖模式抑制ADAM33mRNA和蛋白质的表达水平。rmIFN-γ组,24-48小时ADAM33 mRNA和蛋白质的表达水平开始逐渐恢复;AdCMVmIFN-γ转基因表达mIFN-γ对ADAM33 mRNA和蛋白质的抑制可以持续到96小时。结论IFN-γ可以以时间依赖模式和浓度依赖模式抑制NIH/3T3细胞系中ADAM33的表达;AdCMVmIFN-γ转基因表达mIFN-γ较rmIFN-γ的作用时间更长。第三章应用短发卡RNA慢病毒质粒载体抑制去整合素金属蛋白酶33表达目的针对不同靶点的ADAM33 DNA基因组,在不同区域构建shRNA慢病毒真核表达载体,筛选出ADAM33特异、高效的shRNA片段,抑制ADAM33基因的表达。方法分别在ADAM33基因的前体结构域、金属蛋白酶域和跨膜结构域内,设计4对不同靶点的特异性shRNA序列,构建相应的真核表达载体（pGCL-GFP shRNA1、2、3、4）。分别将这4种质粒瞬时转染入小鼠成纤维细胞3T3中。在转染后24、48和72小时分别采用倒置荧光显微镜观察转染效率、半定量RT-PCR和免疫印迹的方法检测细胞中ADAM33基因及蛋白的表达水平。结果重组质粒经测序证实,其插入序列与目的序列完全一致,说明重组载体构建成功。与对照组相比,pGCL-GFP shRNA3转染48小时后,对ADAM33基因和蛋白表达的干扰效果明显,分别达49.3±2.52%和30.1±5.51%（P＜0.001）。而1、2和4号载体干扰效果相对较弱。结论本研究建立了ADAM33 pGCL-GFP shRNA慢病毒质粒载体,成功干扰了ADAM33基因和蛋白的表达,为下一步制备ADAM33基因敲降的实验动物,研究ADAM33在哮喘发病中的作用提供了有力的工具;ADAM33基因序列中的不同结构域在表达中所起的作用不同,跨膜结构域在ADMA33表达中可能占有重要地位,选择其特异性shRNA序列有可能最大限度地抑制其表达。