血管内皮细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

论文摘要

血管内皮细胞参与血管形成、血管稳态维持、血栓形成、炎症和血管重建等生理和病理过程。血管内皮细胞在血管功能控制方面扮演了重要角色,对血管自身稳定起主要调控作用。为了便于通过Cre/LoxP系统研究相关基因在血管内皮细胞中的功能,我们创建了Tie2-Cre转基因小鼠,利用血管内皮细胞特异性表达的Tie2基因的启动子和增强子驱动Cre重组酶基因在血管内皮细胞中表达。通过显微注射的方法将15.9kb的转基因片段Tie2-Cre引入小鼠受精卵,获得子代小鼠57只,经基因型鉴定有6只小鼠在基因组上整合有Tie2-Cre基因,整合率为11%。通过多组织的RT-PCR证实在所有组织都能检测到Cre重组酶的转录。为了验证Cre重组酶在转基因小鼠中表达的细胞分布及其在体内介导重组的功能,将Tie2-Cre转基因小鼠分别与Smad4条件基因打靶小鼠和ROSA26转基因小鼠交配。Tie2-Cre;Smad4Co/+小鼠的多组织基因组DNA的PCR结果显示Cre重组酶在所有包含血管内皮细胞的组织中表达并能介导LoxP间的重组。对Tie2-Cre;ROSA26双转基因胚胎进行LacZ染色的结果显示,Cre重组酶在所有被检测组织的血管内皮细胞中特异性表达。所有这些结果证实,Tie2-Cre转基因小鼠可作为血管内皮细胞谱系分析和在血管内皮细胞进行条件基因打靶的理想工具小鼠。

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摘要

Abstract

第一章前言

1 血管内皮细胞在发育和疾病中的功能

1.1 胚胎血管发育

1.2 血管内皮屏障

1.3 抗凝血和抗血栓

1.4 炎症反应

1.5 肿瘤的血管形成

2 细胞或组织特异表达Cre重组酶转基因小鼠的应用

3 研究目的和意义

4 研究方法和思路

第二章材料与方法

1 材料与试剂

2 血管内皮细胞特异表达Cre重组酶转基因载体的构建

3 受精卵的显微注射

4 转基因小鼠的基因型鉴定

4.1 小鼠基因组DNA的制备

4.2 转基因小鼠的PCR鉴定

4.3 Southern Blot

5 Cre重组酶转录的检测

5.1 转基因小鼠各组织RNA的提取

5.2 RT-PCR检测Cre重组酶基因的转录

6 Cre重组酶剔除LoxP间靶基因的活性和表达分布的检测

6.1 PCR反应鉴定小鼠基因型及检测Cre重组酶介导Smad4基因的重组

6.2 LacZ染色

第三章结果

1 Tie2-Cre转基因载体的构建

2 首建者转基因小鼠的获得

3 Cre重组酶在不同组织的转录

4 Cre重组酶介导Smad4条件基因打靶小鼠第八外显子的重组

5 Tie2-Cre和ROSA26双转基因胚胎的获得

6 LacZ染色结果

第四章讨论

1 Tie2-Cre转基因小鼠的研制

2 Tie2-Cre转基因小鼠Cre重组酶的表达模式

3 Tie2-Cre转基因小鼠是进行条件基因打靶的理想工具小鼠

第五章结论

参考文献

在读期间发表论著及会议论文

致谢

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