木聚糖酶基因的克隆、表达与酶学性质研究

论文摘要

木聚糖酶在造纸制浆、食品、纺织、饲料、能源工业中具有广阔的应用前景，但是，木聚糖酶要实现有效应用，要求木聚糖酶具有良好的酶学性质，在不同领域的应用要求木聚糖酶具有不同酶学性质。因此开发新的木聚糖酶，获得高产木聚糖酶基因工程菌具有重要的意义。本文采用不同的基因克隆方法分别从短小芽孢杆菌Bacillus pumilus、真菌Plectosphaerella cucumerina和Verticillium dahliae克隆到三个木聚糖酶基因，从土壤微生物DNA中克隆到10个木聚糖酶基因片段。将所克隆的木聚糖酶基因分别在毕赤酵母进行了高效表达，研究了重组酶的酶学性质，为木聚糖酶的有效应用奠定了基础。具体研究结果如下：1．短小芽孢杆菌（B．pumilus）木聚糖酶基因xynHB的克隆和在毕赤酵母的表达通过鸟枪法从短小芽孢杆菌B．pumilus中克隆到一个木聚糖酶基因xynHB，将该基因在毕赤酵母GS115中进行了表达，转化子25℃摇瓶培养在第4天达到最高值644U／mL，重组木聚糖酶的最适反应pH是6-9，最适反应温度是50℃。SDS-PAGE显示基因xynHB在毕赤酵母表达出了分子量分别为32.2kDa和29.6kDa的两条蛋白带，比推测氨基酸的分子量22.4kDa大，活性电泳显示这两条带均有木聚糖酶活性。经Endoglycosidase H去糖基化处理显示这两条带是同一基因表达产物的不同糖基化形式（30％和25％）。将该木聚糖酶的三个糖基化位点分别进行定点诱变，突变体在毕赤酵母进行表达，表达结果显示XynHB蛋白在GS115中表达时，在三个糖基化位点发生糖基化的几率为第一位点>第二位点>第三位点，第三位点发生糖基化的几率很低。同时，还可以看出如果在三个位点分别发生糖基化，就得到29.6kDa的带，如果在第一、第二位点或第一、第三位点同时糖基化，就得到32.2kDa的带，这暗示着基因xynHB在毕赤酵母表达糖基化程度的不同是由于在不同的糖基化位点糖基化的效率不同所致，而不是由于糖链的长短造成的。XynHB突变体的热稳定性实验显示第一糖基化位点的糖基化对提高重组酶的热稳定性有重要影响。2．食线虫真菌P．cucumerina木聚糖酶基因xynZG的克隆、表达及酶学性质研究利用BLAST搜索GenBank上的木聚糖酶，寻找保守氨基酸序列，设计简并引物，以食线虫真菌P．cucumerina的总DNA为模板进行PCR，扩增产物经测序判定为木聚糖酶基因片段。再通过基因组步行PCR的方法获得全长木聚糖酶基因序列。设计引物，通过RT-PCR扩增到该木聚糖酶的全长cDNA xynZG。序列比对显示该木聚糖酶基因全长780bp，含有两个50和46bp的内含子，推测的氨基酸序列和已知木聚糖酶的最高一致性为69％，这是从P．cucumerin克隆到的第一个功能基因。将684bp长的cDNA插入到毕赤酵母表达载体pHBM905B上，重组质粒导入毕赤酵母GS115，挑选在交联木聚糖平板上产生最大水解圈的转化子用于表达研究。25℃诱导3 d，重组木聚糖酶XYNZG表达量达最高362 U／mL。SDS-PAGE电泳检测表达蛋白的分子量为19 kDa。重组木聚糖酶经纯化后测得最适反应pH为6，最适反应温度为40℃。该酶在室温可以稳定10 h，4℃存放5个月仍有90％的酶活。以桦木木聚糖为底物，测得该酶的比酶活为363 U／mg，Km和Vmax分别为2.06 mg／mL和0.49 mmol／min／mg。5 mmol／L的EDTA不影响酶的活性，但是5 mmol／L的金属离子，大多数会抑制酶的活性，尤其是Hg+完全抑制了酶的活性。3．棉花黄萎病真菌V．dahliae木聚糖酶基因xynG的克隆、表达和酶学性质分析通过简并引物扩增真菌V．dahliae木聚糖酶基因片段，基因组步行PCR获得全长木聚糖酶基因序列。经BLAST比对分析，该基因含有一个大小为63 bp的内含子，利用DpnI介导的诱变方法对含内含子的全长木聚糖酶基因进行剪接，获得该基因的全长cDNA，推测的氨基酸序列和已知木聚糖酶的最高一致性为72％。将克隆到的cDNA在毕赤酵母GS115进行了表达，重组酶经纯化后测得该酶最适反应温度为45℃，最适反应pH值为6，在5-9维持50％以上的活性，对山毛榉材木聚糖具有最好的水解效果。Mg2+和Ca2+对酶有激活作用，分别提高了33.7％和16.6％，EDTA，β-巯基乙醇和NaN3对酶的活性基本没有影响，Tween-80和DMSO使酶活性提高了28.4％和12.8％。4．土壤微生物DNA木聚糖酶基因多样性的研究采用国产硅胶GF254代替进口Glass bead的改良方法抽提土壤微生物DNA，然后设计了一对扩增木聚糖酶基因片段的新简并引物，对抽提的土壤微生物DNA进行PCR扩增。扩增片段连接pMD18T载体木聚糖酶基因片段。对所得片段翻译的氨基酸序列进行BLAST分析表明有8个片段，转化大肠杆菌，重组片段通过酶切进行RFLP分析后，测序分析得到10个与来自放线菌的木聚糖酶具有较高的一致性，2个与假单胞菌的木聚糖酶具有较高的一致性。所得10个木聚糖酶片段的氨基酸序列同源性比较显示，第27个氨基酸均为天冬酰胺（N），暗示这些来自土壤微生物DNA的基因片段编码耐碱的木聚糖酶。通过构建系统进化树，发现扩增的木聚糖酶片段之间的一致性均在70％以上。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 前言
• 1.1 研究问题的由来及意义
• 1.2 木聚糖酶的研究进展
• 1.2.1 木聚糖的结构
• 1.2.2 木聚糖的酶解与木聚糖酶的作用机制
• 1.2.3 木聚糖酶的酶学性质
• 1.2.4 木聚糖酶基因的克隆
• 1.2.5 木聚糖酶基因的异源表达
• 1.2.6 木聚糖酶基因的定点诱变
• 1.2.7 木聚糖酶的分子进化
• 1.2.8 木聚糖酶的应用
• 1.2.9 木聚糖酶的研究趋势
• 1.3 毕赤酵母表达系统的研究进展
• 1.3.1 载体的发展
• 1.3.2 受体菌
• 1.3.3 转化方式
• 1.3.4 整合方式
• 1.3.5 获得高拷贝数整合转化子的方法
• 1.3.6 温度对毕赤酵母表达的影响
• 1.3.7 巴斯德毕赤酵母表达菌株的培养条件
• 1.3.8 毕赤酵母的糖基化
• 1.4 本研究的目的
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料和仪器设备
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 酶和试剂
• 2.1.6 仪器和设备
• 2.1.7 主要缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 细菌总 DNA的抽提
• 2.2.2 真菌总 DNA的抽提
• 2.2.3 环境微生物总 DNA的抽提
• 2.2.4 真菌总 RNA的抽提
• 2.2.5 质粒 DNA的抽提
• 2.2.6 亚精胺法纯化 DNA
• 2.2.7 凝胶回收目的 DNA片段
• 2.2.8 溶液回收目的 DNA片段
• 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.10 基因组文库的构建
• 2.2.11 亚克隆的获得
• 2.2.12 大肠杆菌重组子的筛选
• 2.2.13 序列分析
• 2.2.14 基因组步行 PCR（Genome walking PCR）
• 2.2.15 RY-PCR扩增cDNA
• 2.2.16 木聚糖酶毕赤酵母表达载体的构建与验证
• 2.2.17 毕赤酵母感受态细胞的制备及转化
• 2.2.18 重组毕赤酵母在底物平板上的诱导表达
• 2.2.19 外源基因在毕赤酵母中的高密度诱导表达
• 2.2.20 HBP8木聚糖酶的纯化
• 2.2.21 蛋白浓度的测定
• 2.2.22 DpnI介导的糖基化位点的定点诱变
• 2.2.23 SDS-PAGE检测表达蛋白
• 2.2.24 活性 PAGE电泳检测表达木聚糖酶的活性
• 2.2.25 酶的去糖基化处理
• 2.2.26 酶解液中还原糖含量的测定（DNS法）
• 2.2.27 木聚糖酶酶活力单位的定义及酶活力的测定
• 2.2.28 酶反应最适pH的测定
• m、V_max的测定'>2.2.29 酶动力学常数 K_m、V_max的测定
• 2.2.30 金属离子和有机溶剂对酶活性的影响
• 2.2.31 玉米芯木聚糖的制备
• 2.2.32 蔗渣木聚糖的制备
• 3 结果与分析
• 3.1 短小芽孢杆菌 HBP8木聚糖酶基因的克隆、表达及糖基化对热稳定性的影响
• 3.1.1 菌株 HBP8的分离与鉴定
• 3.1.2 B.pumilus HBP8基因组文库的构建及阳性克隆的筛选
• 3.1.3 序列分析
• 3.1.4 XynHB推测氨基酸序列的特征
• 3.1.5 木聚糖酶xynHB基因毕赤酵母表达质粒的构建
• 3.1.6 P.pastoris转化子的获得和温度对木聚糖酶表达的影响
• 3.1.7 木聚糖酶 XynHB的纯化和活性电泳分析
• 3.1.8 重组木聚糖酶 XynHB的去糖基化处理
• 3.1.9 木聚糖酶 XynHB酶学性质的研究
• 3.1.10 木聚糖酶基因xynHB的定点诱变
• 3.1.11 木聚糖酶基因xynHB突变体在毕赤酵母的表达
• 3.1.12 毕赤酵母表达的木聚糖酶基因突变体温度敏感性的研究
• 3.2 食线虫真菌 Plectosphaerella cucumerina木聚糖酶基因xynZG的克隆、表达及酶学性质研究
• 3.2.1 P.cucumerina木聚糖酶基因片段的获得
• 3.2.2 所分离产木聚糖酶真菌的菌种鉴定
• 3.2.3 P.cucumerina木聚糖酶基因全长序列和cDNA的克隆
• 3.2.4 推测蛋白的特征
• 3.2.5 木聚糖酶基因xynZG毕赤酵母表达质粒的构建
• 3.2.6 P. pastoris转化子的获得和温度对木聚糖酶表达的影响
• 3.2.7 木聚糖酶 XYNZG的纯化
• 3.2.8 木聚糖酶 XYNZG酶学性质的研究
• 3.3 棉花黄萎病真菌Verticillium dahliae木聚糖酶基因xynG的克隆、表达和酶学性质分析
• 3.3.1 木聚糖酶基因片段的获得
• 3.3.2 棉花黄萎病真菌的菌种鉴定
• 3.3.3 GWPCR法克隆木聚糖酶基因的全长序列
• 3.3.4 木聚糖酶基因的序列分析
• 3.3.5 木聚糖酶基因cDNA的获得
• 3.3.6 推测氨基酸的序列分析
• 3.3.7 毕赤酵母表达载体的构建
• 3.3.8 重组毕赤酵母的筛选
• 3.3.9 重组酶 XYNG的诱导表达、纯化和酶学性质研究
• 3.4 土壤微生物 DNA木聚糖酶基因多样性的研究
• 3.4.1 土壤微生物 DNA的抽提与木聚糖酶基因片段的扩增效果
• 3.4.2 重组克隆的获得与鉴定结果
• 3.4.3 所得片段的序列分析
• 3.4.4 木聚糖酶片段的同源性比较
• 4 讨论
• 4.1 木聚糖酶基因资源的开发
• 4.1.1 细菌来源
• 4.1.2 真菌来源
• 4.1.3 环境微生物来源
• 4.2 木聚糖酶基因在毕赤酵母的表达
• 4.2.1 表达载体的构建
• 4.2.2 培养温度对表达的影响
• 4.2.3 糖基化对表达的影响
• 4.3 木聚糖酶的酶学性质
• 4.4 土壤微生物木聚糖酶基因的多样性
• 参考文献（References）
• 个人简历
• 致谢