猪链球菌2型三种免疫原性蛋白基因片段的串联表达及其斑马鱼免疫保护试验

论文摘要

猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2）是人和多种动物的病原菌,许多研究表明其免疫原性蛋白可对猪产生免疫保护作用,可作为亚单位疫苗的候选单位。斑马鱼（Danio rerio）具有完整的免疫系统,研究表明,斑马鱼可用于猪链球菌2型感染及其疫苗筛选。以猪链球菌2型HA9801株基因组DNA为模板分别扩增MRP（Muramidase-released protein,溶菌酶释放蛋白）、通过免疫蛋白组学鉴定的免疫原性蛋白HM6 （Dihydrolipoamide dehydrogenase,二氢硫辛酰胺脱氢酶）及GAPDH （Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,磷酸-3-甘油醛脱氢酶）抗原性较好的基因片段,定向克隆至表达载体pET-28a（+）中,重组质粒mrp-pET28a、hm6-pET28a及gapdh-pET28a经限制性酶切鉴定后测序。结果表明插入片段大小分别为531、964、1005bp,与NCBI上猪链球菌2型基因序列相比,同源性均达到99%。将重组质粒转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导可表达分子量分别约为26.0、40.5及41.7kDa的融合蛋白,用猪链球菌2型HA9801株猪康复血清与纯化的融合蛋白进行免疫转印,结果显示融合蛋白MRP、HM6及GAPDH均可被猪链球菌2型HA9801株猪康复血清识别。根据猪链球菌2型mrp及hm6基因序列设计两对引物,分别获取大小为531、964bp的mrp及hm6基因抗原性较强的片段,再通过重叠延伸的方法,将两个基因通过一疏水性柔性多肽接头（Gly4Ser）2碱基序列进行前后拼接,构建新的mrp-linker-hm6融合基因,克隆至pMD18-T Simple载体,经测序分析表明插入片段长度为1525bp,mrp、hm6及接头拼接组合的顺序、方向完全正确。将融合基因定向克隆至pET-28a（+）中,构建重组表达质粒mrp-hm6-pET28a转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导可表达分子量约为59.7kDa的融合蛋白MRP-HM6,免疫转印结果显示MRP-HM6能与猪链球菌2型HA9801株猪康复血清反应。根据猪链球菌2型HA9801株gapdh基因及上述mrp-linker-hm6基因序列设计两对引物,分别获取gapdh基因和mrp-linker-hm6基因片段,应用重组PCR技术将两个片段通过一疏水性柔性多肽接头（Gly4Ser）碱基序列进行前后拼接,构建新的gapdh-linker-mrp-linker-hm6融合基因,定向克隆至pET-28a（+）,构建重组原核表达质粒gapdh-mrp-hm6-pET28a。重组质粒经限制性酶切鉴定后测序,结果表明插入片段长度为2545bp, gapdh、mrp-linker-hm6及接头拼接组合的顺序、方向完全正确。将重组质粒gapdh-mrp-hm6-pET28a转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达分子量分别约为95.5kDa的融合蛋白GAPDH-MRP-HM6,纯化后免疫转印结果显示该融合蛋白可被猪链球菌2型HA9801株猪康复血清识别。用复壮后的猪链球菌2型HA9801株通过腹腔注射斑马鱼,测定其对斑马鱼的半数致死量LD50为2.39×105CFU／尾。将350尾斑马鱼随机分成7组,每组50尾,分别用50μg纯化的MRP、HM6、GAPDH、MRP-HM6、GAPDH-MRP-HM6融合蛋白及1×107CFU猪链球菌2型HA9801株全菌灭活苗免疫斑马鱼,首免14d后同样剂量加强免疫一次,对照组注射25μL灭菌PBS。二免后第14d用50LD50 HA9801株进行攻击,连续观察7d。结果表明,对照组斑马鱼全部死亡,MRP、HM6、GAPDH、MRP-HM6及GAPDH-MRP-HM6融合蛋白免疫组的相对保护率分别为38%、38%、32%、50%、48%,猪链球菌2型HA9801株全菌灭活苗组的相对保护率达到62%。以上结果表明,用MRP、HM6、GAPDH及其串联原核表达产物免疫斑马鱼,可使其对同源菌株攻击产生一定的保护作用,可为猪链球菌2型亚单位疫苗的研制提供参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 猪链球菌2型基因工程亚单位疫苗研究进展
• 1 猪链球菌2型疫苗概述
• 2 猪链球菌2型亚单位疫苗研究进展
• 2.1 溶菌酶释放蛋白（Muramidase-released protein,MRP）
• 2.2 胞外因子（Extracellular protein facter,EF）
• 2.3 溶血素（SLY）
• 2.4 38kDa蛋白
• 2.5 SS2其他具免疫保护作用的蛋白
• 2.6 SS2重组亚单位二联苗的研究
• 3 展望
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第二章 猪链球菌2型江苏分离株MRP、HM6、GAPDH基因片段的克隆表达及免疫反应性鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 基因组DNA的提取
• 1.3 目的基因扩增
• 1.4 质粒pET-28a（+）的提取及双酶切
• 1.5 原核表达载体mrp-pET28a、hm6-pET28a、gapdh-pET28a的构建
• 1.6 MRP、HM6、GAPDH融合蛋白的诱导表达
• 1.7 SDS-PAGE检测融合蛋白的表达
• 1.8 融合蛋白的纯化及免疫转印
• 2 结果
• 2.1 原核表达载体mrp-pET28a、hm6-pET28a、gapdh-pET28a的构建
• 2.2 MRP、HM6、GAPDH融合蛋白的诱导表达、纯化及免疫转印
• 2.3 测序结果分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 猪链球菌2型江苏分离株MRP、HM6、GAPDH基因片段串联表达载体的构建及其表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 目的基因扩增
• 1.3 串联表达载体mrp-hm6-pET28a的构建及鉴定
• 1.4 串联表达载体gapdh-mrp-hm6-pET28a的构建及鉴定
• 2 结果
• 2.1 串联表达载体mrp-hm6-pET28a以及gapdh-mrp-hm6-pET28a的构建
• 2.2 融合蛋白MRP-HM6、GAPDH-MRP-HM6的诱导表达、纯化及免疫原性分析
• 2.3 串联表达质粒测序结果及分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 猪链球菌2型HA9801株重组表达蛋白对斑马鱼的免疫保护力评价
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株、试剂及仪器
• 1.2 试验动物
• 1.3 免疫原制备
• 1.4 SS2苏分离株HA9801的斑马鱼毒力试验
• 1.5 斑马鱼的主动免疫保护试验
• 2 结果
• 2.1 菌株复壮
• 2.2 毒力试验
• 2.3 安全性试验
• 2.4 斑马鱼主动免疫保护试验
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢