论文摘要
捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属毛圆科（Trichostrongy,idae）血矛属（Haemonchus）线虫,是山羊等反刍动物的主要胃肠道寄生虫之一,患病动物通常表现为贫血、消瘦甚至死亡,造成巨大经济损失。目前的主要防治方法是使用化学药物驱虫,但随着抗药性虫株的出现,化学药品治疗正受到严重的挑战,人们正努力寻求通过免疫学的方法,代替化学药物控制该病。目前,捻转血矛线虫免疫学方面的研究已取得了重要进展,但尚无商品化疫苗用于该病的防控。对该寄生虫发育与调控研究可深入了解其生物学特性,从而为控制该病提供更多的研究思路。本研究进行了捻转血矛线虫Hcher-1和HcMSP基因的克隆和原核表达,研究了其部分生物学特性,并对其在各发育阶段的表达情况进行了定量分析,并对其在虫体发育过程中的功能做出了预测。1.捻转血矛线虫Hcher-1基因的克隆、表达及免疫原性分析根据C.elegans,C.briggsn和B.malayi的her-1基因保守序列设计引物,从捻转血矛线虫cDNA中扩增出597bp的DNA片段,经克隆测序后以此EST为基础,利用5’RACE和3’RACE技术分别获得该基因的5’端和3’端未知序列,将这些序列拼接后获得捻转线虫Hcher-1基因的全长cDNA序列（1091bp）,序列分析发现,该基因含有一个960bp的最大开放阅读框（ORF）、67bp5’非翻译区和64bp3’非翻译区。根据此ORF设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出960bp的DNA片段,与推导的ORF长度相同。将该片段克隆到pET-28a（+）载体中,转化大肠杆菌Rosseta,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达,分子量约38kDa。以该重组蛋白免疫大鼠制备血清作为一抗,western blot分析天然HcHER-1蛋白,结果在约35kDa处出现特异性条带,与其理论大小一致。2.捻转血矛线虫HcMSP基因的克隆、表达及免疫原性分析根据捻转血矛线虫雄虫总蛋白的质谱分析结果和GenBank中秀丽新杆线虫主要精子蛋白（MSP）核苷酸序列（登录号为173888）设计一对特异性引物,利用RT-PCR技术获得捻转血矛线虫HcMSP基因的表达序列标签EST。依据此EST设计基因特异性引物,利用5’RACE和3’RACE技术分别获得该基因的5’端和3’端未知序列,将这些序列拼接后获得捻转血矛线虫HcMSP基因的全长cDNA序列（439bp）。序列分析发现,该基因含有一个381bp的最大开放阅读框（ORF）.17bp5’非翻译区和41bp3’非翻译区。根据此ORF设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出381bp的产物。将该片段连接到原核表达质粒pET28a（+）,转化大肠杆菌Rosseta, IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明重组蛋白在上清和包涵体中均有表达,分子量约为18kDa。以自然感染山羊血清为一抗,western blot分析未发现相应条带,说明捻转血矛线虫主要精子蛋白可能是一种隐蔽抗原。以该重组蛋白免疫大鼠制备血清为一抗,western blot分析,天然HcMSP蛋白分子量约为15kDa。3. Hcher-1和HcMSP基因阶段性表达特性分析根据前期工作克隆到的捻转血矛线虫Hcher-1和HcMSP基因全长序列设计荧光定量PCR引物。SYBR Green I染料荧光定量法对所设计引物的扩增效率验证,筛选符合要求的引物。用△△Ct法对这两个基因在捻转血矛线虫的虫卵期,第三期幼虫期,雌虫和雄虫中的表达情况进行定量分析。结果显示Hcher-1在雄虫中表达量最高,虫卵和三期幼虫其次,约为雄虫表达量的1/3,雌虫中最低,约为雄虫表达量的1/8; HcMSP在雄虫中的表达量最高,虫卵其次,约为雄虫表达量的1/8,雌虫和三期幼虫最低,约为雄虫的1/800。