黄瓜花叶病毒M株系侵染性cDNA克隆的构建及3a基因的原核表达

论文摘要

以感染黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）M株系的白肋烟为材料，提取植物总RNA，通过反转录合成cDNA，通过PCR扩增分别获得了CMV-M基因组3段全序列—RNA1、RNA2和RNA3。构建了噬菌体T7 RNA聚合酶启动子控制下的CMV-M三段全长cDNA克隆pUC-1、pUC-2和pUC-3。序列分析表明CMV-M RNA1全长3361个核苷酸，含有一个开放阅读框架（ORF1），编码分子量为112ku的1a蛋白。5’NTR长93nt，3’NTR长222nt；RNA2全长3037个核苷酸，含有两个开放阅读框架（ORF2，3），编码分子量为96.7ku的2a蛋白以及分子量为13.1ku的2b蛋白。5’NTR长87nt，3’NTR长299nt。CMV-M RNA3全长2215个核苷酸，含有两个开放阅读框（ORF4，5），分别编码分子量为31ku的3a蛋白和分子量为24ku的外壳蛋白（CP）。5’NTR长120nt，3’NTR长289nt。将CMV-M全长基因组cDNA分别克隆至pUC18载体中得到pUC-1、pUC-2和pUC-3。将重组质粒pUC-1、pUC-2和pUC-3用限制性内切酶SphⅠ线性化，以该线性化产物为模板进行体外转录，体外转录物混合摩擦接种于白肋烟表明具有侵染性，接种在叶片上产生与野生型病毒接种相同的花叶症状，同时可以在接种植物中检测到病毒RNA。为近一步研究CMV-M 3a基因与病毒致病性间的关系，利用CMV-M RNA3全长cDNA克隆构建了运动蛋白MP（3a基因编码的移动蛋白）的原核表达载体。SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导，MP基因在大肠杆菌BL21中高效表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 黄瓜花叶病毒的研究进展
• 1.1.1 症状表现
• 1.1.2 株系划分
• 1.1.3 基因组结构
• 1.1.4 黄瓜花叶病毒国内外研究进展
• 1.1.5 黄瓜花叶病毒M株系国内外研究概述
• 1.2 侵染性克隆的研究进展
• 1.2.1 侵染性病毒研究进展
• 1.2.2.侵染性克隆与病毒分子生物学
• 1.2.3 侵染性克隆的种类
• 1.2.4 侵染性克隆构建的策略
• 1.2.4.1 侵染性转录物的产生
• 1.2.4.2 侵染性克隆的产生与鉴定
• 1.2.4.3 影响体外转录物侵染性的因素
• 1.2.5 侵染性cDNA克隆的应用
• 1.2.5.1 病毒基因功能的研究
• 1.2.5.2 新型疫苗的研究
• 1.2.5.3 RNA病毒作为载体表达外源基因编码的蛋白
• 1.3 本课题研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒原的采集及保存
• 2.1.2 接种方式
• 2.1.3 菌株和质粒
• 2.1.4 生化及分子生物学试剂
• 2.1.5 寡聚核苷酸引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 植物总RNA的提取
• 2.2.2 RT-PCR
• 2.2.2.1 反转录反应
• 2.2.3 PCR扩增
• 2.2.4 PCR产物的纯化
• 2.2.5 连接反应
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.7 连接产物转化大肠杆菌
• 2.2.8 碱裂解法提取质粒DNA
• 2.2.9 序列分析
• 2.2.10 全序列cDNA重组载体的构建
• 2.2.11 体外转录
• 2.2.12 摩擦接种及症状观察
• 2.2.13 含CMV-M-3a基因的原核表达载体的构建
• 2.2.14 CMV-M-3a基因的诱导表达
• 2.2.15 表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.2.15.1 样品的制备
• 2.2.15.2 SDS-PAGE
• 2.2.15.3 Western blot分析
• 2.2.15.4 融合蛋白的切胶回收
• 3 结果及分析
• 3.1 CMV-M侵染现象的观察结果
• 3.2 CMV-M的基组全序列及分析
• 3.2.1 CMV-M基因组全序列PCR的扩增
• 3.2.2 CMV-M基因组核苷酸全序列分析
• 3.2.3 小结
• 3.3 CMV-M侵染性cDNA克隆的构建及侵染性检测
• 3.3.1 CMV-M全序列cDNA克隆的构建
• 3.3.2 体外转录和摩擦接种
• 3.3.3 体外转录物侵染性的RT-PCR检测
• 3.3.4 讨论
• 3.4 3a Gene的原核表达
• 3.4.1 3a基因片断的PCR扩增
• 3.4.2 pET22b-MP重组表达载体的构建
• 3.4.3 融合蛋白表达的检测
• 3.4.4 讨论
• 4 讨论
• 5 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介