论文摘要
猪流感（Swine influenza,SI）是由正黏病毒科猪流感病毒（SIV）引起的一种急性、高度接触传染性的群发性猪呼吸道疾病,目前已发现的SIV至少有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H9N2和H5N1等8种不同血清亚型。血凝抑制试验（HI）和神经氨酸酶抑制试验（NI）是流感病毒亚型鉴定的常用方法,另外琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等其他血清学方法也用于猪流感病毒亚型的检测,但是这些方法都存在灵敏度低且经验依赖性强等特点。PCR是一种快速准确的检测方法,但是普通的PCR方法只能一次对一种亚型进行检测,不能满足实际检测的需要。本研究根据流感病毒的HA和NA基因序列间的差异性,采用基因芯片技术,借助多重PCR和核酸标记技术,构建了猪流感病毒亚型分型基因芯片,用于猪流感病毒亚型的分型,具有检测A型流感病毒和同步鉴别猪流感病毒H1、H3、H9、N1和N2亚型的功能。本研究共分为以下3部分:1猪流感病毒分型基因芯片的建立本部分主要包括芯片的设计和制备、探针浓度和Biotin-11-dUTP使用浓度的选择,杂交时间和杂交温度的优化,芯片的灵敏度、特异性、重复性和稳定性检测。根据Genbank发表的核酸序列,运用DNAstar软件,分析流感病毒的HA和NA基因序列间的差异性,分别设计合成流感病毒H1、H3、H9、N1和N2的特异分型引物,并根据A型流感病毒的型特异性基因（M基因）,设计了A型流感病毒的通用引物。应用RT-PCR分别扩增各亚型的特异片断,并分别克隆到pMD18-T Simple Vector构建重组质粒,用于各亚型探针的制备。将各探针测序后,应用BLAST对扩增产物测序结果与相应病毒亚型核酸序列的进行同源比对,证明与相应亚型的大部分毒株同源性在90%以上。将各探针纯化后,统一稀释为75 ng/μL,按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上,80℃烤膜2 h,制备成低密度基因芯片,并对芯片制备和杂交条件的优化以及芯片的性能进行测定。结果筛选出制备芯片的Biotin-11-dUTP使用浓度为80μM,探针浓度为75 ng/μL,杂交温度为42℃,杂交时间1 h。制备的芯片具有良好的特异性和可重复性,灵敏度比PCR高1个稀释度,比病毒分离高2个稀释度。该方法的建立,为猪流感的检测及猪流感病毒各亚型在猪群中的流行病学调查提供了一种快速、灵敏和高通量的手段。2不对称PCR在基因芯片中的应用利用不对称PCR可以制备单链PCR产物,较少基因芯片杂交时自身杂交的损失,提高基因芯片的杂交率,但同时也会减少PCR的最终产物。本试验选择了1:25、1:50、1:100和1:200的稀释滴度,芯片对比检测结果显示,在引物浓度为1:100时杂交结果最好,与不用不对称PCR的芯片检测结果相比,灵敏度提高了1～2个稀释度。3猪流感病毒分型基因芯片的初步应用利用制备好的基因芯片检测了从青岛、烟台、潍坊、济宁、南昌、葫芦岛等市健康猪群或病死猪采集的鼻拭子或组织426份,检测结果和PCR的符合率在87%以上,鸡胚传代病毒分离检测结果同基因芯片与PCR的检测结果相差比较大。结果表明猪流感病毒分型基因芯片可以作为猪流感病毒监测的一种重要手段,其灵敏度高于PCR方法。