矮沙冬青三个抗逆相关基因的克隆

论文摘要

矮沙冬青（Ammopiptanthus nanus）又称新疆沙冬青,与蒙古沙冬青（Ammopiptanthus mongollcus）同属豆科沙冬青属,是第三纪古地中海消失后残遗在塔里木盆地边缘荒漠的超旱生常绿阔叶灌木,间断性分布于西天山与昆仑山的结合部,以新疆克孜勒苏柯尔克孜自治州乌恰县为中心,少量延伸至吉尔吉斯斯坦边境。由于自然历史原因和人类经济活动的影响,特别是过度放牧及樵采,矮沙冬青种群衰退严重,被列为国家二级濒危保护植物。沙冬青对干旱、寒冷、贫瘠、盐碱和高温等非生物逆境耐受性极强。在形态结构方面,沙冬青枝叶密被柔毛,角质层厚,栅栏组织发达,气孔少且下陷,叶表皮细胞的液泡大,贮存水分多。沙冬青主根发达,侧根密集,输导组织发达,能充分吸收土层深处水分。沙冬青细胞内含有大量高活性抗冻蛋白,加之脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质在干旱等逆境胁迫下含量增高,致使沙冬青原生质黏稠,束缚水含量较高,水势较低,蒸腾作用弱,具有很强的吸水保水能力。因此,沙冬青抗逆性的分子解析及相关基因克隆,可为作物的抗逆性研究和转基因利用提供参考和外源基因。在蒙古沙冬青方面,胚胎后期富集蛋白、乙烯应答元件结合因子、脱水素、细胞循环相关蛋白、RNA结合蛋白、肌醇半乳糖苷合成酶、亚精胺合成酶、细胞壁连接的类受体激酶、Na+/H+逆向转运蛋白、钙调磷酸酶B样蛋白1、抗冻蛋白等的十几个抗逆相关蛋白的编码基因已经克隆测序,有的还通过转基因验证其抗逆功能。但是,矮沙冬青与蒙古沙冬青的遗传差异较大,基因序列的同源性不高,同源克隆不易成功。因此,本研究采用同源克隆结合cDNA末端快速扩增的策略,从500mmol/L NaCI和4℃低温处理8h的矮沙冬青幼嫩叶片中,克隆获得钼辅助因子硫酸化酶（AnMCSU）、磷脂酶Dα1（AnPLDα1）和Ⅰ型液泡膜焦磷酸酶（AnVP1）3个蛋白的编码基因全长cDNA序列,通过生物信息学软件分析并扩增获得其开放阅读框,再将开放阅读框的推导氨基酸序列与其他物种的同源氨基酸序列进行同源性比对,构建系统进化树,分析推导氨基酸序列中的保守结构域。主要结果如下：1.矮沙冬青钼辅助因子硫酸化酶（AnMCSU）编码基因全长cDNA序列2544bp,包含一个长2289bp的开放阅读框,编码762个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,矮沙冬青钼辅助因子硫酸化酶（AnMCSU）与拟南芥钼辅助因子硫酸化酶（ABA3/LOS5）同源性最高（58.01%）。2.矮沙冬青磷脂酶Dαl （AnPLDα1）编码基因全长cDNA序列2832bp,包含一个长2427bp的开放阅读框,编码808个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,矮沙冬青磷脂酶Dαl（AnPLDα1）与蓖麻磷脂酶Dα1（RcPLDα1）、烟草磷脂酶Dαl（NtPLDα1）和蒺藜苜蓿磷脂酶Dα（MtPLDα）的同源性分别达85.64%、84.41%和73.03%。3.矮沙冬青Ⅰ型液泡膜焦磷酸酶（AnVP1）编码基因全长cDNA序列2684bp,包含一个长2298bp的开放阅读框,编码765个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,矮沙冬青Ⅰ型液泡膜焦磷酸酶（AnVP1）与蒺藜苜蓿Ⅰ型液泡膜焦磷酸酶（MtVP1）同源性最高（94.51%）。上述3个新克隆的基因序列己申请中国专利,专利申请号为201210148464.8、201210148625.3和201210148680.2。下一步转化相应的拟南芥突变体验证功能后,有望应用于抗非生物逆境的转基因作物研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 植物非生物胁迫
• 1.1.1 植物抗逆生理生化的研究
• 1.1.2 植物抗逆渗透物质的研究
• 1.1.3 植物抗逆分子生物学的研究
• 1.1.4 植物抗逆转基因研究
• 1.2 沙冬青
• 1.2.1 生理生化特性的研究
• 1.2.2 分子生物学的研究
• 1.2.3 遗传进化的研究
• 1.3 cDNA末端快速扩增
• 1.3.1 经典RACE技术的原理
• 1.3.2 5＇RLM-RACE技术
• 1.3.3 RACE技术在植物基因克隆中的运用
• 1.4 钼辅助因子硫酸化酶
• 1.4.1 ABA生物合成
• 1.4.2 拟南芥钼辅助因子硫酸化酶ABA3/LOS5
• 1.4.3 ABA3/LOS5的功能验证
• 1.5 磷脂酶D
• 1.5.1 磷脂酶D的发现及分类
• 1.5.2 磷脂酶D基因的功能
• 1.5.3 磷脂酸信号
• 1.5.4 磷脂酶Dα1的功能及信号调节途径
• +-焦磷酸转移酶'>1.6 H⁺-焦磷酸转移酶
• 1.6.1 植物质子泵的种类
• +-PPase的类别'>1.6.2 H⁺-PPase的类别
• +-PPase的生物学效应'>1.6.3 H⁺-PPase的生物学效应
• 2 材料与方法
• 2.1 矮沙冬青总RNA提取
• 2.2 反转录合成cDNA第一链
• 2.3 中间片段克隆
• 2.4 基因3＇端克隆
• 2.5 基因5＇端克隆
• 2.6 完整序列拼接
• 2.7 基因ORF序列克隆
• 2.8 生物信息学预测
• 3 结果与分析
• 3.1 矮沙冬青叶片总RNA质量
• 3.2 矮沙冬青AnMCSU基因
• 3.3 矮沙冬青AnPLDa1基因
• 3.4 矮沙冬青AnVP1基因
• 4 讨论
• 4.1 mRNA可变剪接
• 4.2 AnMCSU基因功能预测
• 4.3 AnPLDa1基因功能预测
• 4.4 AnVP1基因功能预测
• 4.5 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录