喹诺酮类兽药免疫胶体金快速检测试纸条的研制

论文摘要

喹诺酮类药物是一类人工合成的新型杀菌性抗菌药物,能够抑制细菌DNA合成,但由于此类药物大量且不合理使用,其引起的耐药性和毒副作用已经引起众多国家的重视。为了保护消费者的健康,对食品中喹诺酮类药物残留的检测非常重要。免疫层析试纸条方法具备简单快速,灵敏度高,该方法适用于大批量牛奶样品中喹诺酮药物残留检测。首先实验室利用半抗原诺氟沙星（NOR）与牛血清蛋白（BSA）连接制得免疫原免疫兔子得到的多克隆抗体,本论文中利用间接酶联免疫法测定了该抗体的特异性以及灵敏度,结果表明该抗体可识别16种喹诺酮类药物。之后用胶体金作为标记物,根据竞争抑制免疫层析原理,对喹诺酮类兽药残留快速检测试纸条方法进行了系统的研究。主要采用柠檬酸三钠法制备20nm胶体金,并利用喹诺酮类药物多克隆抗体和半抗原偶联物（NOR-OVA）研制出喹诺酮类多残留免疫层析试纸条。16种喹诺酮类兽药多残留试纸条方法检出限在1ng/mL～10ng/mL之间。牛奶实际样品（经HPLC检测为阴性样品）经过处理后进行喹诺酮类药物快速检测试纸条的添加回收实验,结果表明回收现象较好。喹诺酮类药物在牛奶样品基质中的最低检出限均低于其在欧盟、美国、以及我国制定的最高残留限量。与间接酶联免疫法结果较相符。试纸条在4℃下密封干燥条件下至少可保存2个月。该试纸条检测方法灵敏度高,快速,简便,10min内即可得出检测结果。所研制的试纸条适用于动物源性食品中喹诺酮类药物残留的大批量检测。

论文目录

摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 兽药检测概述

1.1.1 兽药残留危害

1.1.2 兽药残留常用分析方法

1.2 免疫胶体金层析技术概述

1.2.1 免疫胶体金技术的发展历史

1.2.2 胶体金的性质和特点

1.2.3 胶体金的制备

1.2.4 金标抗体复合物的制备与保存

1.2.5 胶体金免疫层析技术概述

1.3 喹诺酮类药物简介

1.3.1 喹诺酮类药物的发展历史

1.3.2 喹诺酮类药物结构与性质

1.3.3 喹诺酮类药物的抗菌作用机制

1.3.4 喹诺酮类药物的毒性作用

1.3.5 动物源性食品中喹诺酮类药物的残留

1.3.6 喹诺酮类药物检测方法

1.4 论文研究的目的和意义

1.5 论文研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 仪器及材料

2.1.3 待测样品

2.1.4 溶液的配制

2.2 实验方法

2.2.1 抗喹诺酮类药物多克隆抗体的预处理

2.2.2 胶体金的制备

2.2.3 胶体金标记抗体蛋白

2.2.4 免疫层析试纸条组成材料的选择

2.2.5 层析条件的选择

2.2.6 试纸条的组装

2.2.7 免疫层析试纸条检测方法和结果判断

2.2.8 免疫层析试纸条检测限的确定

2.2.9 方法特异性的检测

2.2.10 重复性实验

2.2.11 实际样品的检测

2.2.12 酶联免疫吸附法验证试纸条方法的有效性

2.2.13 试纸条稳定性实验

3 结果与讨论

3.1 喹诺酮多克隆抗体及包被原的预处理

3.1.1 喹诺酮抗体的纯化

3.1.2 抗体浓度的测定

3.1.3 包被原的紫外扫描鉴定

3.1.4 间接ELISA法检测抗体灵敏度

3.1.5 喹诺酮抗体特异性鉴定

3.2 胶体金溶液的制备与质量鉴定

3.2.1 胶体金的制备

3.2.2 胶体金的质量鉴定

3.3 胶体金标记抗体蛋白

3.3.1 胶体金标记抗体最适pH的测定

3.3.2 胶体金标记抗体最适蛋白量的测定

3.4 金标抗体的质量鉴定

3.5 免疫层析试纸条组成材料的选择

3.5.1 硝酸纤维素膜的选择

3.5.2 胶体金结合释放垫和样品垫的选择

3.6 层析条件的选择

3.6.1 抗原和二抗稀释液的选择

3.6.2 抗原包被量、羊抗兔稀释倍数和金标抗体稀释倍数的选择

3.6.3 包被原包被条件的选择

3.6.4 金标抗体干燥条件的选择

3.6.5 喹诺酮标准品稀释液的选择

3.7 免疫层析试纸条检测限的确定

3.7.1 喹诺酮类药物多残留试纸条检测限的确定

3.8 方法的特异性

3.8.1 喹诺酮类药物多残留试纸条方法特异性的确定

3.9 重复性实验

3.10 实际样品的检测

3.10.1 样品基质影响的消除

3.10.2 样品检测限的确定

3.10.3 待测物添加回收实验

3.11 酶联免疫吸附法法验证有效性

3.12 试纸条稳定性实验

3.12.1 喹诺酮类药物多残留试纸条稳定性实验

4 结论

5 展望

6 参考文献

7 论文发表情况

8 致谢

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