刺糖多孢菌中两个脂肪酶基因的克隆和应用研究

论文摘要

本研究利用PCR从刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）S08-4中扩增两个类似为脂肪酶的基因：ORF154（828bp）和ORF454（825 bp）。将两基因的终止密码子TGA突变为CTC,通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点克隆到表达载体pET30a（+）上,转化大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）, IPTG诱导表达在羧基端带有纯化标签His6-Tag的融合蛋白,其表观分子量分别为32 kDa和33 kDa,且蛋白以有活性的可溶性形式存在。将表达的目的蛋白通过Co2+亲和层析纯化,并通过Vivaspin 2 Polyethersulfone （MWCO:10kDa）超滤离心管脱盐、浓缩处理,最后蛋白储存于TNG Buffer中。经计算,每毫克工程菌菌体（湿重）中能分离得到lip154蛋白18.8μg, lip454蛋白1μg；在60℃、pH8.0的条件下,以对硝基苯基棕榈酸酯（pNPP）为底物测得lip154和lip454的比活力分别为0.65 IU/mg和0.05 IU/mg。根据脂肪酶基因ORF154和ORF454碱基序列及所编码的氨基酸序列,在NCBI上分别对其进行了基因和蛋白序列的比对,发现其与已经公开发表的脂肪酶基因序列、蛋白序列具有很高的相似性,特别是ORF154与来源于红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea） NRRL 2338的脂肪酶基因覆盖率为88%,一致性为75%。两基因编码的蛋白lip154和lip454均有第一家族脂肪酶活性位点G-X1-S-X2-G的高度保守序列,并且预测1ip154有典型的盖子序列区域,其序列为I-V-A-F-R-G。对两脂肪酶lip154和lip454分别进行了酶学性质考察。lip154的最适反应温度为100℃,最适pH值为9.0,为超嗜热的碱性脂肪酶,120℃下40min残余活性还有24%,能耐受乙腈和25%（v/v）浓度下的异丙醇,Hg2+ （1mM）和DTT提高酶活,Co2+抑制酶活,最适底物为对硝基苯基辛酸酯（C8）；lip454的最适反应温度为70℃,最适pH值为10.0,为嗜热的碱性脂肪酶,对有机溶剂的耐受性要比1ip154强,1mM Cu2+和10mM的Li+提高酶活,Co2+抑制酶活,最适底物为对硝基苯基肉豆蔻酸酯（C14）。脂肪酶1ip154和lip454有着特殊的酶学特征,这些特征暗示酶有着特殊的工业用途。我们用lip454在有机溶剂体系中,醇油摩尔比为2：1的条件下,采用分批加入甲醇的方法,催化制备得到了生物柴油,反应的转化率约为30%,产物经气相色谱检测分析为五种不同碳链长度的脂肪酸甲酯。脂肪酶是水解脂肪分子中甘油酯键的一种脂酶,超嗜热且耐碱性脂肪酶的耐热、抗碱及不受其它物质的抑制等优越性使其在实际应用中的范围更广泛,体现出巨大的开发及应用潜力,是国内外脂肪酶研究的一个重要方向。在众多的脂肪酶中,既能耐热又抗碱的脂肪酶为数不多。本文为后续研究奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 脂肪酶的来源
• 1.3 脂肪酶催化的反应类型
• 1.4 微生物脂肪酶的结构
• 1.5 微生物脂肪酶的催化机理
• 1.6 嗜热脂肪酶简介
• 1.7 脂肪酶活力测定的方法
• 1.8 脂肪酶应用
• 1.9 微生物脂肪酶与生物柴油
• 1.10 本课题主要研究内容和意义
• 第二章 脂肪酶基因的克隆和表达载体的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 供试菌株、载体及试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 培养基与抗生素
• 2.2.4 引物与测序
• 2.2.5 常用溶液和缓冲液
• 2.2.6 刺糖多孢菌基因组DNA的提取
• 2.2.7 大肠杆菌质粒DNA的小量提取
• 2.2.8 脂肪酶基因的PCR扩增
• 2.2.9 表达载体的构建
• 2.2.10 E.coli细胞感受态的制备
• 2.2.11 大肠杆菌的转化及转化子的筛选
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 刺糖多孢菌的培养
• 2.3.2 脂肪酶基因的克隆及序列分析
• 2.3.3 表达载体的构建
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 重组菌蛋白的表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要试剂与溶液
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.2.4 蛋白的诱导表达
• 3.2.5 酶的纯化
• 3.2.6 蛋白含量的测定
• 3.2.7 pNPP法测定酶活
• 3.2.8 蛋白结构预测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 蛋白表达
• 3.3.2 脂肪酶的纯化
• 3.3.3 蛋白的含量
• 3.3.4 脂肪酶的活力
• 3.3.5 蛋白结构
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 刺糖多孢菌脂肪酶的酶学性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 缓冲液的配制
• 4.2.4 温度对脂肪酶活性的影响
• 4.2.5 pH对脂肪酶活性的影响
• 4.2.6 金属离子和抑制剂等对脂肪酶活性的影响
• 4.2.7 有机溶剂对脂肪酶活性的影响
• 4.2.8 底物的碳链长度对脂肪酶活性的影响
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 温度对脂肪酶活性的影响
• 4.3.2 pH对脂肪酶活性的影响
• 4.3.3 金属离子和抑制剂等对脂肪酶活性的影响
• 4.3.4 有机溶剂对脂肪酶活性的影响
• 4.3.5 酶对不同碳链长度底物的催化活性
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 脂肪酶催化合成生物柴油的初步研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要试剂
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 脂肪酶催化合成生物柴油
• 5.2.4 生物柴油的气相色谱检测分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 生物柴油的合成
• 5.3.2 生物柴油气相色谱检测
• 5.4 小结讨论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间撰写和发表的论文