细胞色素P450 2E1增强顺铂肝毒性的机理研究

论文摘要

顺铂是最有效的抗癌药物之一,但是由于其严重的毒副作用而限制了它的临床应用。除了主要限制剂量的肾脏毒性外,高剂量顺铂也可引起肝脏毒性。氧化应激在顺铂引起的肝脏毒性中起重要作用。细胞色素P450 2E1 （CYP2E1）主要在肝脏表达,但在脑、肾脏、肺脏、胃肠道和淋巴结也有少量表达。与其它类型的细胞色素P450不同,由于其与NADPH-细胞色素P450还原酶结合不紧密,CYP2E1显示出很强的NADPH氧化酶活性,可产生大量的超氧化物阴离子自由基（O2.-）和过氧化氢（H2O2） ,在铁催化剂存在的情况下可产生更强的氧化剂如羟自由基（OH.-）。CYP2E1的诱导可增强铁和多不饱和脂肪酸引起的肝脏毒性,高表达的CYP2E1可增强Fas激动剂Jo2和内毒素诱导的氧化性肝脏损伤。本研究旨在探讨升高的CYP2E1对顺铂诱导的肝损伤的影响。本研究采用的实验动物为雄性C57BL-6小鼠,随机分为2组,分别为对照组和CYP 2E1诱导组,后者喂含2%丙酮的自来水7天以诱导CYP2E1。对照组和CYP 2E1诱导组再分别分为2组,即顺铂组和对照组,前者经腹腔注射顺铂45 mg/kg。24小时后处死动物,并取样检测。结果显示,喂丙酮水的小鼠CYP2E1活性比对照小鼠升高1倍;Western blot分析表明CYP2E1蛋白含量升高1.5倍。小鼠腹腔注射45mg/kg的顺铂可诱导血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）分别升高2倍和4倍。在丙酮顺铂联合组,血清ALT和AST比单纯顺铂组分别高1倍和40%。单纯顺铂组病理检查显示明显的细胞变性,但无细胞坏死;在丙酮顺铂联合组,可见广泛的细胞坏死。顺铂可诱导Caspase-3活性升高1倍,TUNEL染色阳性率约5%,丙酮顺铂联合组Caspase-3活性进一步升高大约30%,TUNEL染色阳性率则升高到13%。为进一步证明丙酮是通过CYP2E1增强顺铂的肝毒性,在实验中引入CYP2E1基因敲除小鼠。SV129背景的CYP2E1基因敲除小鼠及其野生型正常对照小鼠喂含2%丙酮的自来水7天后腹腔注射45mg/kg的顺铂,结果显示CYP2E1基因敲除小鼠的血清ALT和AST比野生型正常对照小鼠分别低约40%和30%,TUNEL和Caspase-3阳性染色也低于对照小鼠。以上结果证明CYP2E1在丙酮增强顺铂肝毒性的过程中起重要作用。如果丙酮增强顺铂的肝毒性是由于其诱导的CYP2E1,那么可能的机制是CYP2E1介导的氧化应激和顺铂介导的氧化应激协同,从而增强了肝毒性。脂质过氧化产物丙二醛（MDA）和4-羟烯（HAE）在单纯顺铂组升高25% （P<0.05）,而丙酮顺铂联合组则进一步升高20% （P<0.05）。蛋白羰基形成是蛋白氧化损伤的早期指标。单纯顺铂组可检测到明显升高的蛋白羰基形成,而丙酮顺铂联合组则更高于单纯顺铂组。一氧化氮（NO.）和O2.-可快速发生反应产生过氧亚硝酸盐（ONOO-）,后者可使酪氨酸硝基化形成3-硝基酪氨酸（3-NT）。单纯顺铂组可检测到较弱的3-NT,丙酮顺铂联合组则强于单纯顺铂组。铁是自由基形成的催化剂,单纯顺铂组可检测到较弱的铁染色,丙酮顺铂联合组则强于单纯顺铂组。以上结果表明丙酮诱导CYP2E1升高的同时可增强顺铂的肝毒性,在此过程中氧化应激可能起重要作用。为进一步深入研究CYP2E1增强顺铂的肝毒性的机制,我们利用转染并表达人CYP2E1的HepG2细胞（E47细胞）和只转染了空载体而不表达人CYP2E1的HepG2细胞（C34细胞）建立CYP2E1促进顺铂肝脏毒性的体外细胞模型。同样浓度的顺铂孵育同样时间, C34细胞毒性明显小于E47细胞。为验证E47细胞对顺铂更敏感可能与细胞内的CYP2E1促进顺铂诱导的氧化应激有关,我们检测了细胞内谷胱甘肽（GSH）含量和活性氧类（ROS）产生量。顺铂使E47和C34细胞GSH含量均下降,而E47细胞下降的幅度更大。顺铂可致E47和C34细胞ROS产生量上升,而E47细胞上升的幅度更大。这些结果表明,顺铂诱导的氧化应激在E47细胞比C34细胞更明显。为进一步证明氧化应激的作用,我们用抗氧化剂和助氧化剂做干预试验。DL-甲硫氨酸磺酰亚胺（BSO）系GSH耗竭剂,能促进顺铂诱导的E47和C34细胞毒性,但对E47细胞毒性的促进作用更大。谷胱甘肽乙酯（GSHE）能很容易地被细胞摄取,然后在细胞内被代谢成GSH;去铁敏（DFO）是铁鳌合剂,可预防铁催化的更强氧化剂如羟自由基的产生。GSHE和DFO都可使顺铂诱导的E47细胞毒性下降,表明顺铂诱导的E47细胞毒性与氧化应激有关。二稀丙基硫化物（DAS）是CYP2E1的抑制剂,也能降低顺铂诱导的E47细胞毒性,提示CYP2E1在顺铂诱导的E47细胞毒性中的重要作用。为探讨MAPK在顺铂细胞毒中的作用,E47和C34细胞分别用P38 MAPK、JNK和ERK的抑制剂P38MAPK抑制剂（SB203580）、JNK抑制剂（SP600125）和ERK抑制剂（U0126）预先处理1小时,然后再加不同浓度的顺铂,24小时后用噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率。三种MAPK抑制剂中,只有ERK抑制剂U0126能降低顺铂诱导的E47和C34细胞毒,表明ERK可能在顺铂细胞毒中起作用。为证明ERK确实被活化,我们检测ERK的活化形式p-ERK。无论是E47细胞还是C34细胞,顺铂都诱导ERK活化,U0126也抑制该活化作用,表明U0126确实是通过抑制ERK活化来抑制顺铂细胞毒。虽然E47细胞对顺铂比C34细胞更敏感,但是ERK活化幅度并没有明显不同。推测ERK活化时间的早晚可能是一重要因素,所以进一步观察ERK活化的时间进程。由于0.25 mM浓度的顺铂作用24小时只造成E47细胞毒性,而不引起C34细胞毒性,所以我们采用0.25 mM浓度的顺铂。无论是E47细胞还是C34细胞,顺铂都诱导较持久的ERK活化,但在E47细胞ERK活化得更早一些。为进一步探讨ERK的早期活化对E47细胞敏感性的作用,在加顺铂之后不同时间加U0126,再检测其对顺铂细胞毒性的影响。在加顺铂1、2、4、8小时之后加U0126,对两种细胞都有防护作用,但在加顺铂16小时之后再加U0126,只可降低顺铂对C34细胞的毒性而不能降低其对E47细胞的毒性。以上结果表明,ERK的持久激活在顺铂诱导E47和C34细胞毒作用中都起重要作用,而ERK早期活化使E47细胞对顺铂更敏感。GSH耗竭剂BSO能促进顺铂诱导的细胞毒性,但对E47细胞毒性的促进作用更大。结果发现,BSO可增强顺铂诱导的ERK活化,在E47细胞增强的幅度大于C34细胞;在E47和C34细胞,U0126都可降低BSO增强的ERK活化。U0126也可降低BSO与顺铂联合诱导的细胞毒性。以上结果表明,BSO通过增强ERK活化而增强顺铂诱导的细胞毒性,U0126则可降低BSO增强的ERK活化而防护细胞毒。检测ROS发现,与ERK活化一样,ROS的上升在E47细胞早于C34细胞。U0126可降低单纯顺铂或BSO与顺铂联合诱导的E47细胞和C34细胞内升高的ROS。细胞内GSH耗竭可导致ROS积累,所以我们检测了细胞内GSH含量。顺铂使E47和C34细胞内GSH含量随时间逐渐下降,E47细胞内GSH含量下降时间早于C34细胞,下降幅度也大于C34细胞。令人惊奇的是,尽管U0126可降低顺铂诱导的细胞毒,也可降低细胞内升高的ROS,但是U0126对顺铂诱导的细胞内GSH含量下降毫无影响。BSO与顺铂联合可进一步降低细胞内GSH含量,但同样地U0126对细胞内GSH含量毫无影响。给细胞补充GSHE可阻止单独顺铂或BSO与顺铂联合诱导的E47细胞毒性,降低ERK活化和细胞内ROS含量。顺铂可诱导细胞坏死和凋亡。由于MTT实验无法区分细胞坏死和凋亡,所以我们用PI染色鉴定细胞坏死和凋亡。首先对活细胞用PI染色观察细胞坏死（细胞核被染成红色荧光即为坏死细胞）,细胞固定后再用PI染色观察细胞凋亡（细胞核浓缩或碎裂即为凋亡细胞）。0.25mM浓度的顺铂作用16小时后,在C34细胞未检测到坏死,而在E47细胞可检测到大约20%细胞坏死;BSO与顺铂联合可导致20%的C34细胞坏死,而95%的E47细胞坏死。U0126可防护顺铂单独或与BSO联合诱导的细胞坏死。细胞凋亡检测发现,顺铂作用16小时后,在C34细胞仅检测到个别细胞凋亡,而在E47细胞可检测到大约50%的细胞凋亡,但U0126对顺铂诱导的细胞凋亡没有防护作用;BSO与顺铂联合后却检测不到细胞凋亡,有趣的是,加U0126后在E47细胞则可检测到大约10%的细胞凋亡,而在C34细胞则观察不到这种现象。由此可见,顺铂的细胞毒主要表现在诱导细胞凋亡,少部分是细胞坏死,U0126可预防坏死,但对细胞凋亡没有防护作用;BSO可使顺铂诱导的细胞凋亡转换为细胞坏死,U0126可有效预防这种坏死,同时也可部分地将这种细胞坏死逆转为细胞凋亡。这种现象被另一种凋亡检测手段Annexin V染色证实。顺铂诱导的细胞凋亡是依赖caspase的,所以我们又检测了caspase-3、-8和-9的活性。在C34细胞,各种处理均未明显增加三种caspase的活性。但在E47细胞,顺铂可明显增加三种caspase的活性,U0126对顺铂诱导的caspase活性没有影响;BSO降低顺铂诱导的caspase活性,但U0126却明显使它们升高。这些caspase的变化趋势与经PI和Annexin V染色观察到的细胞凋亡趋势是一致的。为进一步评价caspase在顺铂诱导的细胞毒过程中的作用,我们在E47细胞观察了总caspase抑制剂Z-VAD-FMK对顺铂单独或与BSO联合诱导的细胞死亡。Z-VAD-FMK可抑制顺铂单独诱导的凋亡,但对顺铂与BSO联合诱导的细胞坏死没有影响,提示BSO与顺铂联合诱导的坏死不是从凋亡转化过来的。如上所述,顺铂可诱导ROS的产生,而BSO可增强顺铂诱导的ROS产生;U0126和GSHE均可降低被顺铂或BSO与顺铂联合诱导的ROS产生,因而可保护顺铂或BSO与顺铂联合诱导的细胞毒。为进一步评价ROS在细胞死亡模式转化中的作用,我们又观察了几种抗氧化剂对其作用。BSO与顺铂联合诱导的坏死可被超氧化物阴离子自由基清除剂MnTMP、维生素E类似物Trolox、铁鳌合剂DFO和GSH补充剂GSHE等防护,各种抗氧化剂保护效果类似,表明氧化应激在BSO与顺铂联合诱导的坏死中起重要作用。但是,除了GSHE外,其它抗氧化剂都没有将BSO与顺铂联合诱导的坏死转化为凋亡,提示GSHE对细胞死亡模式的转化作用不是因为其抗氧化作用。GSHE与其它抗氧化剂比较,一个重要的不同是GSHE含巯基,而其它抗氧化剂不含巯基。Caspase是半胱氨酸蛋白酶,在其活性中心含有的半胱氨酸残基是维持其活性所必需的。GSH可调节细胞内氧化还原状态,预防半胱氨酸的巯基被氧化修饰而使酶失活。因而推测,细胞内GSH被BSO降低后,Caspase中半胱氨酸的巯基被氧化,故而Caspase酶失活,细胞毒性表现出的不是凋亡而是坏死。相反,GSHE可阻止或恢复半胱氨酸巯基的氧化,因而可将坏死又转化为凋亡。结果发现,GSHE确实可升高BSO与顺铂联合诱导的caspase活性下降,检测细胞内GSH发现GSHE果然可升高细胞内GSH。上述结果表明细胞内GSH对维持caspase活性和将BSO与顺铂联合诱导的坏死转化为凋亡起重要的作用。虽然U0126可部分将BSO与顺铂联合诱导的坏死转化为凋亡,也可恢复或升高caspase活性,但我们未观察到U0126对细胞内GSH含量有影响。这提示可能有另一种来源的巯基可代替GSH调整细胞内氧还状态。我们检测了细胞内硫氧还蛋白（TRX）。TRX是另一巯基还原剂,与GSH有互补作用。在E47细胞,顺铂使TRX表达急剧下降,BSO与顺铂联合则使TRX表达进一步下降;但是在C34细胞,TRX表达没有任何变化。U0126可恢复顺铂或BSO与顺铂联合诱导的TRX表达下降。GSHE也可部分恢复顺铂或BSO与顺铂联合诱导的TRX表达下降。为证明TRX的作用,我们用TRX siRNA降低E47细胞TRX表达,再经顺铂或BSO与顺铂联合处理。和非特异性对照siRNA相比,TRX siRNA可抑制TRX在E47细胞的表达,U0126也不能恢复被TRX siRNA抑制的TRX表达,TRX表达被TRX siRNA抑制后,顺铂细胞毒性增强,被BSO与顺铂联合处理所抑制的caspase-3活性没有进一步下降,但可部分阻止U0126对caspase-3活性的恢复作用,类似地,U0126对凋亡的恢复作用也被部分阻止。由上可推测,U0126不仅可抑制ERK的活化,还可上调TRX的表达,当GSH被BSO降低时,TRX可代替GSH维护caspase的活性,使U0126对坏死既有防护作用又可部分将坏死转化为凋亡。至于U0126如何上调TRX的表达,有待进一步研究。本研究体内与体外试验的结果表明,升高的CYP2E1能增强顺铂诱导的肝毒性,其机制可能与升高的ROS产量和氧化应激有关。采用过表达CYP2E1的HepG2细胞,顺铂诱导较早而持久的ERK活化,ERK的活化可促进ROS的产生,而ROS又可进一步激活ERK,如此互相促进,从而导致更严重的细胞损伤。顺铂可诱导HepG2细胞坏死和凋亡,而ERK的活化可促进顺铂诱导的坏死而不是凋亡。谷胱甘肽被BSO耗竭后,顺铂诱导的细胞凋亡转化为坏死,巯基抗氧化剂使顺铂诱导的细胞坏死又可转化为凋亡,而其它非巯基抗氧化剂则不能。硫氧还蛋白可代替谷胱甘肽促进顺铂和BSO诱导的细胞坏死转化为细胞凋亡;ERK可促进顺铂诱导的硫氧还蛋白下降而促进顺铂和BSO诱导细胞坏死。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 第一部分 细胞色素 P450 2E1 增强顺铂诱导的小鼠肝毒性
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• （五） 第二部分 CYP2E1 促进顺铂对 HepG2 细胞的毒性: ROS 和 ERK 的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• （六） 第三部分 顺铂诱导的 E47 细胞死亡模式:ERK、ROS、GSH 和硫氧还蛋白的调节作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、缩略词表
• 四、博士在读期间发表的论文
• 五、致谢