蝎毒抗神经兴奋肽ANEPⅢ的神经保护作用及其抗神经兴奋机制的研究

论文摘要

中国东亚钳蝎抗癫痫肽（AEP）是具有药用价值的活性多肽。动物模型研究表明，AEP具有良好的抗癫痫抗惊厥作用。从中国东亚钳蝎cDNA文库筛选到三种氨基酸序列并不完全与AEP一致的抗神经兴奋肽基因，通过质粒表达，可使这三种基因分别在大肠杆菌中得到可溶性表达，我们将这三种肽命名为ANEPⅠ、ANEPⅡ和ANEPⅢ。在硫代氨基脲、印防己毒素、戊四唑等致惊剂致试验动物模型中具有较好的抗神经兴奋的作用，其中ANEPⅢ活性较强。本研究首先应用RT-PCR技术考察了原代培养的新生大鼠海马和皮层神经元各通道亚型的表达情况，证明培养的神经元表达多种离子通道亚型，应用膜片钳技术测定电压依赖性钠电流、钾电流以及钙电流，亦证明培养的神经元较好地保持了神经元功能。研究发现，ANEPⅢ能够明显提高原代培养的新生大鼠海马和皮层神经元谷氨酸以及无镁损伤的细胞存活率，并能有效防止LDH渗漏。在缺血／缺氧损伤模型中，ANEPⅢ同样可以提高神经元存活率，但对LDH渗漏无显著影响。时滞显微摄影技术检测谷氨酸致海马和皮层神经元细胞肿胀实验结果表明，终浓度为300-3000nM ANEPⅢ和20μM的MK-801均可明显抑制谷氨酸（500μM）所致的海马和皮层神经元细胞肿胀。AO／EB染色观察ANEPⅢ对谷氨酸诱发细胞凋亡和死亡结果显示，终浓度为300nM的ANEPⅢ和终浓度为20μM MK-801对谷氨酸介导的神经细胞死亡有明显保护作用。以钙荧光指示剂Fluo-3／AM染色，用荧光强度代表细胞内钙离子浓度，应用激光扫描共聚焦显微镜技术考察了ANEPⅢ对原代培养的海马和皮层神经元细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响。结果显示，30-3000nM ANEPⅢ可以显著抑制KCl引起大鼠海马和皮层神经元[Ca2+]i的升高，说明ANEPⅢ可能作用在电压依赖性钙离子通道上，阻断细胞外钙通过电压依赖性离子通道内流到细胞胞浆中。在谷氨酸介导的海马和皮层神经元钙超载模型中发现，ANEPⅢ和NMDA非竞争性拮抗剂MK-801均能显著抑制谷氨酸引起的海马和皮层神经元[Ca2+]i的升高，对谷氨酸引起的钙升高的双峰均有显著抑制作用。30-3000nM的ANEPⅢ可显著降低海马神经元[Ca2+]i；30nM的ANEPⅢ对谷氨酸引起的皮层[Ca2+]i的升高无显著影响，在终浓度为300-3000nM时亦可以显著降低皮层神经元([Ca2+]i的水平。为进一步研究ANEPⅢ的神经作用机制，我们应用膜片钳的全细胞记录模式考察了ANEPⅢ对原代培养的新生大鼠海马和皮层神经元电压依赖性离子通道电流的影响。结果表明，ANEPⅢ能够以电压依赖的方式降低原代培养的海马和皮层神经元钠电流，且呈剂量依赖关系。ANEPⅢ对海马和皮层神经元抑制的IC50分别为214.76 nM和124.57nM。1000 nM的ANEPⅢ可使钠离子稳态激活曲线向正向漂移，海马神经元漂移的电流-电压关系为9.7 mV；皮层神经元漂移的电流-电压关系为5.7 mV。ANEPⅢ还能使钠离子复活过程减慢，但对钠离子INa稳态激活过程无明显影响。研究中发现，ANEPⅢ对海马和皮层神经元电流-电压关系的影响不同，这可能是因为存在于不同细胞类型上的钠通道分布情况不同，而且性质也不完全一致所致。ANEPⅢ对瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流以及对它们通道动力学的影响实验结果显示，细胞外给予ANEPⅢ，能够以时间和浓度依赖的方式降低延迟整流钾电流幅度，3000 nM的ANEPⅢ可以使海马和皮层神经元IK幅度分别降低28.2％和23.6％，对上述两种神经元IK影响的IC50值分别为155.1 nM和227.2 nM。ANEPⅢ所有浓度组对瞬时外向钾电流没有明显影响，通道动力学研究表明，ANEPⅢ对IA和IK的通道动力学特征无显著影响。对钙离子电流的研究表明，ANEPⅢ可剂量依赖地降低钙电流的幅值。应用RT-PCR技术研究了ANEPⅢ对原代培养的大鼠海马和皮层神经元基因转录的影响。结果表明，1000 nM的ANEPⅢ慢性孵育神经元能够明显影响电压依赖性离子通道在原代培养的大鼠海马和皮层神经元膜上的表达。1．海马神经元Nav1.1 mRNA表达量在ANEPⅢ预孵育3小时、12小时、皮层神经元Nay1.2 mRNA表达量在ANEPⅢ预孵育24h与孵育前相比明显降低且有显著性差异。海马神经元Nav1.3和Nav1.6亚型、皮层神经元Nav1.1、Nav1.3和Nav1.6 mRNA表达量孵育后与孵育前相比无显著性差异。2．海马神经元Kv1.5 mRNA表达量在预孵育3h、12h、24h和48h时、皮层Kv1.5 mRNA表达量在预孵育24 h与孵育前相比明显降低且有显著性差异。皮层神经元Kv2.1 mRNA表达量在ANEPⅢ预孵育12h时与孵育前相比明显升高且有显著性差异。海马神经元Kv2.1、Kv4.2 mRNA表达量和皮层Kv4.2 mRNA表达量在预孵育3h、12h、24h和48h时与孵育前相比无显著性差异。3．海马神经元Caα-1C mRNA表达量在ANEPⅢ预孵育24h、海马Caα-1G mRNA表达量在ANEPⅢ预孵育24h、48h时、皮层神经元Caα-1GmRNA表达量在预孵育24h时与孵育前相比明显降低且有显著性差异，皮层Caα-1GmRNA表达量在ANEPⅢ预孵育3h、12h、24 h和48h时与孵育前相比均无显著性差异。本研究结果表明ANEPⅢ对神经元的保护作用以及抗神经兴奋机制至少和其拮抗钙离子内流有关。其对原代培养的大鼠海马和皮层神经元钠电流和延迟整流钾电流的影响均有利于神经元兴奋性的降低，这些可能也是ANEPⅢ发挥抗癫痫作用的机制之一。

论文目录

• 英文缩写
• 中文摘要
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• 前言
• 第一部分 新生大鼠海马皮层神经元的原代培养、电生理学特性以及离子通道表达
• 第一节 概述
• 第二节 材料与方法
• 第三节 实验结果
• 第四节 讨论
• 第五节 小结
• 第二部分 蝎毒抗神经兴奋肽ANEPⅢ对原代培养的海马和皮层神经元可能的神经保护作用研究
• 第一节 概述
• 第二节 材料与方法
• 第三节 实验结果
• 第四节 讨论
• 第五节 小结
• 2+]_i的影响'>第三部分 蝎毒抗神经兴奋肽ANEPⅢ对原代培养的大鼠海马和皮层神经元[Ca²⁺]_i的影响
• 第一节 概述
• 第二节 材料与方法
• 第三节 实验结果
• 第四节 讨论
• 第五节 小结
• 第四部分 蝎毒抗神经兴奋肽ANEPⅢ对原代培养的大鼠海马和皮层神经元离子通道电流的影响
• 第一节 概述
• 第二节 材料与方法
• 第三节 实验结果
• 第四节 讨论
• 第五节 小结
• 第五部分 蝎毒抗神经兴奋肽ANEPⅢ对原代培养的大鼠海马和皮层神经元离子通道基因转录的影响
• 第一节 概述
• 第二节 材料与方法
• 第三节 实验结果
• 第四节 讨论
• 第五节 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文