水稻硫氧还蛋白OsTRXh1结合蛋白的鉴定及功能研究

论文摘要

植物体内氧化还原状态的稳定性对于体内各种生理过程的正常进行发挥重要的作用。植物在正常的生长发育过程以及受到生物和非生物胁迫时,体内就会产生活性氧,而这种活性氧的产生就会打破正常生理状态下的氧化还原平衡,植物自身就会启动防御机制清除活性氧来恢复体内氧化还原平衡。硫氧还蛋白作为一种具有氧化还原活性的蛋白,其参与调节了植物体内的氧化还原平衡。对于硫氧还蛋白靶蛋白的研究,可以使我们更能全面地了解硫氧还蛋白所参与的各种途径及作用机制。特别是随着蛋白质组学技术的发展,在植物中已经鉴定到大量的硫氧还蛋白潜在靶蛋白,研究表明硫氧还蛋白几乎参与到细胞内各种途径当中。水稻质外体硫氧还蛋白（OsTRXhl）是通过双向电泳及质谱技术系统分析在不同时间进程盐胁迫下水稻根尖质外体可溶性蛋白的变化情况后,发现的一个盐反应表达上调的蛋白。研究表明,该蛋白具有典型的氧化还原活性,并且功能研究表明其可能参与了水稻生长发育和逆境胁迫反应的调节途径。本课题的主要目的就是通过蛋白质组学的方法来鉴定OsTRXhl的靶蛋白,并对这些靶蛋白进行进一步的验证,从而进一步阐述OsTRXhl的作用机理和分子机制。利用点突变体OsTRXhlC43s,以亲和层析技术和蛋白质组学技术相结合的手段,通过一维电泳和双向电泳分离鉴定了OsTRXhl靶蛋白,共得到238个候选结合蛋白。通过对这些蛋白进行相关文献查阅及生物信息学分析,根据亚细胞定位和功能做了简单的分类,最终我们筛选出感兴趣的10个蛋白作为我们的研究对象。通过双分子荧光互补技术,我们又进一步验证了这10个蛋白与OsTRXhl的相互作用。实验结果表明,在我们进行鉴定的10个蛋白（RPN、ADH1、KHAL3、NRX、TCP10、βGLU、RIC1 L-APX1、UP和SO）中RPN、HAL3、NRX、RIC1、L-APX1和UP6个蛋白和OsTRXhl有相互作用。

论文目录

• 缩写表
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一部分 文献综述
• 1 植物中硫氧还蛋白的研究进展
• 1.1 硫氧还蛋白的种类
• 1.2 硫氧还蛋白的理化特性
• 1.3 植物硫氧还蛋白生物学功能
• 2 植物中硫氧还蛋白靶蛋白研究进展
• 2.1 植物中硫氧还蛋白的两个系统
• 2.2 植物中硫氧还蛋白靶蛋白研究方法
• 2.3 展望
• 第二部分 研究论文
• 材料与方法
• 1 材料与试剂
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种和载体
• 1.3 实验试剂和仪器
• 1.4 培养基
• 2 实验方法
• 2.1 水稻幼苗的培养
• 2.2 体外重组蛋白的诱导表达
• 2.3 水稻幼苗全蛋白提取
• 2.4 纯化靶蛋白
• 2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.6 胶体蓝染色
• 2.7 蛋白荧光标记
• 2.8 双向电泳
• 2.9 细菌感受态的制备
• 2.10 RNA的提取及纯度和含量的测定
• 2.11 RT-PCR扩增相关目的基因
• 2.12 目的片段的回收
• 2.13 目的基因与克隆载体的重组
• 2.14 大肠杆菌感受态的转化
• 2.15 阳性克隆的鉴定
• 2.16 克隆载体与目的载体的重组反应
• 2.17 农杆菌感受态的转化
• 2.18 农杆菌介导的烟草遗传转化
• 2.19 激光共聚焦显微镜观察
• 结果与分析
• 1 靶蛋白的纯化
• 2 靶蛋白的分析
• 2.1 基于单向电泳的蛋白质组学分析
• 2.2 基于双向电泳的蛋白质组学分析
• 3 靶蛋白的筛选
• 4 靶蛋白与OsTRXh1的一对一验证
• 4.1 RPN与OsTRXh1相互作用情况
• 4.2 ADH1与OsTRXh1相互作用情况
• 4.3 HAL3与OsTRXh1相互作用情况
• 4.4 NRX与OsTRXh1相互作用情况
• 4.5 TCP1θ与OsTRXh1相互作用情况
• 4.6 pGLU与OsTRXh1相互作用情况
• 4.7 RIC1与OsTRXh1相互作用情况
• 4.8 L-APX1与OsTRXh1相互作用情况
• 4.9 UP与OsTRXh1相互作用情况
• 4.10 SO与OsTRXh1相互作用情况
• 讨论
• 1 水稻质外体硫氧还蛋白（OsTRXh1）靶蛋白的鉴定
• 2 水稻质外体硫氧还蛋白（OsTRXh1）靶蛋白的筛选
• 3 靶蛋白与OsTRXh1相互作用的一对一验证
• 4 展望
• 结论
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢