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缺血缺氧状态下内皮祖细胞的自噬变化及其对细胞存活和增殖的作用

2020-12-11阅读(633)

缺血缺氧状态下内皮祖细胞的自噬变化及其对细胞存活和增殖的作用

论文摘要

目的研究EPCs （endothelial progenitor cells）在缺血缺氧状态下的自噬变化,探讨自噬在细胞存活和增殖中的作用。方法用密度梯度离心法从人脐带血中分离单形核细胞,用VEGFR-2、CD34、CD133抗体标记后通过流式细胞仪（flow cytometry, FCM）分选VEGFR-2+CD34+和VEGFR-2+CD133+细胞,进一步通过免疫细胞化学染色观察VEGFR-2、CD34、CD133在EPCs上的共表达,将分选出的EPCs在VEGF作用下诱导扩增。建立大鼠心肌梗死模型,选择3个部位即正常心肌、梗死周边及梗死区心肌分别将FG （fibrin glue）承载的EPCs注射入心肌组织中。通过半薄切片观察FG承载的EPCs在心肌组织中的分布,透射电镜观察不同部位移植的EPCs的自噬变化。为了明确自噬对细胞增殖和活性的影响,本研究用3-MA抑制EPCs自噬后,通过流式细胞分析细胞周期,MTT法检测细胞活性的变化；在检测缺氧状态下细胞的自噬变化中,该研究在体外模拟缺氧微环境,将分选后的EPCs分为五组：对照组、缺氧1组、缺氧2组、缺氧3组和3-MA组,缺氧1、2、3组分别缺氧30min、1h、2h,在3-MA组中,先用浓度为5mmol/L的3-MA预处理细胞1h,然后缺氧1h。经缺氧处理后,通过免疫细胞化学染色及RT-PCR检测各组细胞自噬基因Beclin-1的表达变化；结合LC3免疫细胞化学染色和MDC染色检测自噬体及阳性细胞数目变化；用透射电镜观察自噬前体、自噬体和自噬溶酶体的形态特征,通过VLCDS图像分析软件测量各组细胞中自噬相关结构与细胞断面面积,对两者比值进行统计学分析及比较；经溶酶体示踪剂lysoSensorTMND-189标记溶酶体后检测其数目变化。为了明确自噬对缺氧状态下细胞存活的作用,本文采用AO/EB染色及流式细胞分析检测自噬对缺氧状态下细胞凋亡的影响。结果与移植于正常心肌的EPCs相比,移植到心梗周边区心肌中的EPCs数量变化不明显并且细胞内出现少量自噬体,但移植到梗死区的EPCs数量明显减少且细胞中出现大量自噬体,还可观察到位于梗死区的EPCs出现坏死变化。在细胞增殖和活性的检测中,观察到与对照组相比,3-MA阻断自噬后,EPCs的增殖指数下降,细胞活性降低。随着缺氧时间的延长,自噬基因Beclin-1表达增强,含LC3或MDC标记的自噬体及阳性细胞数目增多,自噬体主要分布于核周边的细胞质中。透射电镜下观察到的自噬前体可呈新月形或杯状的双层膜结构,新月形自噬前体较厚而杯状自噬前体较薄,自噬体可表现为双层膜包裹的圆形或椭圆形结构,自噬前体或自噬体包绕细胞质样无形结构或受损的线粒体,自噬溶酶体为包绕单层膜自噬体的单层膜结构；与对照组相比,随着缺氧时间的延长,自噬结构与细胞断面面积之比增大,与缺氧1h组相比,3-MA组细胞自噬结构与细胞断面面积之比明显减小。缺氧状态下,溶酶体数目增多且体积变大,3-MA组细胞中溶酶体数目明显降低。在自噬与凋亡关系研究中,检测到缺氧1h可引起少量细胞发生凋亡,阻断自噬后缺氧引起的细胞凋亡数目显著增加。结论自噬与EPCs的增殖和活性维持有关。缺血缺氧诱导EPCs自噬增强,细胞可通过自噬降低缺氧引发的细胞凋亡。

论文目录

  • 英文縮略词表
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 第一部分 EPCs在缺血缺氧微环境中的自噬变化
  • 材料和方法
  • 1 实验材料和实验动物
  • 2 仪器和试剂
  • 2.1 仪器
  • 2.2 试剂
  • 3 脐带血单形核细胞的分离
  • 3.1 Percoll液的制备
  • 3.2 单形核细胞分离
  • 4 EPCs的分选及鉴定
  • 5 大鼠心肌梗死模型建立与细胞移植
  • 5.1 心肌梗死模型建立
  • 5.2 FG移植复合物的制备
  • 5.3 细胞移植
  • 6. 自噬检测
  • 6.1 取材及透射电镜标本制备
  • 6.2 半薄切片及自噬超微结构的电镜观察
  • 结果
  • 1 EPC的生物学特征
  • 1.1 EPCs的含量及表面标记物观察
  • 1.2 EPCs的形态特征
  • 2 移植后的EPCs数目和超微结构变化
  • 讨论
  • 第二部分 自噬对缺氧条件下EPCs存活的调节作用
  • 材料和方法
  • 1 实验材料
  • 2 仪器和试剂
  • 2.1 仪器
  • 2.2 试剂
  • 3 细胞增殖检测
  • 3.1 流式细胞仪分析细胞周期
  • 3.2 MTT法检测细胞活力
  • 4 缺氧模型建立及实验分组
  • 5 自噬基因、蛋白及相关结构的检测
  • 5.1 自噬基因Beclin-1的检测
  • 5.2 MDC染色
  • 5.3 LC3免疫化学染色
  • 6 自噬的超微结构检测
  • 7 溶酶体标记
  • 8 细胞凋亡与存活的检测
  • 8.1 AO/EB染色
  • 8.2 流式细胞仪分析
  • 9 统计学分析
  • 结果
  • 1 自噬对细胞增殖和活性的影响
  • 1.1 自噬抑制后细胞增殖周期变化
  • 1.2 自噬抑制后细胞活性变化
  • 2 缺氧后Beclin-1的表达变化
  • 3 缺氧后的自噬结构变化
  • 3.1 MDC阳性结构数目变化
  • 3.2 LC3阳性结构数目变化
  • 4 缺氧对细胞自噬超微结构的影响
  • 5 缺氧后溶酶体数目变化
  • 6 自噬抑制后细胞凋亡变化
  • 6.1 凋亡细胞形态及数目变化
  • 6.2 凋亡细胞的流式分析结果
  • 讨论
  • 全文小结
  • 参考文献
  • 综述
  • 参考文献
  • 在读期间发表论文
  • 致谢

    • 相关论文文献

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