水稻果胶甲基酯酶基因的克隆及表达研究

论文摘要

果胶甲基酯酶（Pectin methylesterase，PME）普遍存在于植物细胞中，主要起内源调控植物细胞壁上以及细胞之间果胶含量的作用，并与植物根边缘细胞产生及释放有关。果胶甲基酯酶基因是一个基因家族，有些成员具有表达时空特异性。本研究通过克隆水稻果胶甲基酯酶基因，利用大肠杆菌表达体系和毕赤酵母表达体系进行PME蛋白的表达研究，并构建了不同的水稻果胶甲基酯酶基因表达载体，转化至水稻和拟南芥中，以探究果胶甲基酯酶基因表达与边缘细胞产生和释放的关系，以及对植物根尖抗逆境行为的影响。本研究的主要实验结果如下：（1）从水稻中克隆了与根边缘细胞释放相关的pme基因以及pme基因的抑制区（pectin methylesterase inhibitor，PI）、PME基因的功能区（pectin methylesterase doman，PD）、PME基因的反向序列（anti-pectinmethVlesterase，AP）。构建了四个植物表达载体：pCAMBIA13011-OS-pme，pCAMBIA13011-OS-Anti-pme，pCAMBIA13011-OS-pmeⅠ-Doman，pCAMBIA13011-OS-pme-Doman，通过农杆菌介导转化至水稻和拟南芥，得到转基因株系并得到验证。（2）利用大肠杆菌表达系统，构建大肠杆菌表达载体pET28a-OS-pme，导入大肠杆菌表达菌株BL21中，在IPTG诱导下表达PME蛋白，通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达分子量及含量，结果表明大肠杆菌表达蛋白基本以包涵体形式存在，分子量约为68KDa，与预期大小相符，并以pET28a载体上的His·tag为抗体通过Western blotting鉴定证实。（3）利用毕赤酵母表达体系，构建酵母重组表达质粒pPIC9K-OS-pme。将重组质粒转化巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），在甲醇诱导下获得PME蛋白的分泌表达，通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达分子量及含量，结果表明表达上清中有轻度糖基化的PME蛋白的分泌表达，分子量约为68KDa，与预期大小相符，并初步验证其活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 果胶甲基酯酶（pectin methylesterase,PME）在植物细胞发育以及植物抗逆境中的作用
• 1.1 果胶及果胶甲基酯酶（PMEs）
• 1.2 果胶甲基酯酶调节植物果实的成熟
• 1.3 果胶甲基酯酶在植物花粉管发育中的作用
• 1.4 果胶甲基酯酶的表达与边缘细胞产生以及抗逆境胁迫的作用
• 1.5 展望
• 2 植物酸铝胁迫与耐胁迫生理机制的研究进展
• 2.1 土壤中铝的形态及铝毒作用形式
• 2.2 铝毒对植物的损害位点
• 2.3 植物根细胞壁中铝的积累和分布
• 2.4 植物耐铝的遗传分析
• 2.4.1 耐铝的质量遗传位点
• 2.4.2 耐铝的数量遗传位点
• 2.5 铝毒机理及植物耐铝胁迫机制
• 2.5.1 植物铝毒的机理
• 2.5.1.1 铝毒对果胶甲基酯酶活性的影响
• 2.5.1.2 铝毒对植物营养物质吸收的影响
• 2.5.1.3 铝毒影响植物细胞的分裂和伸长
• 2.5.1.4 铝毒引起的细胞死亡
• 2.5.1.5 铝毒影响细胞内外的信号传导
• 2.5.2 植物耐铝机制
• 2.5.2.1 外部排斥机制
• 2.5.2.2 内部耐受机制
• 2.6 植物根系阳离子交换量与耐铝性的关系
• 3 植物根尖边缘细胞发育及其生物学功能的研究
• 3.1 边缘细胞的产生
• 3.2 边缘细胞的生物学特征
• 3.2.1 不同物种边缘细胞的数量、大小、活性及其遗传潜力
• 3.2.2 边缘细胞的粘液层及其成分
• 3.3 边缘细胞的生物学功能
• 3.4 边缘细胞的研究和应用潜力
• 4 本研究的提出
• 第二章 水稻果胶甲基酯酶基因的克隆及表达研究
• 第一节 水稻果胶甲基酯酶基因的克隆及其水稻和拟南芥的转化
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试植物
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 载体质粒
• 2.1.4 试剂
• 2.2.实验方法
• 2.2.1 水稻Pectin Methylesterase（Pme）基因的克隆
• 2.2.1.1 水稻根尖总RNA的提取
• 2.2.1.2 cDNA的合成
• 2.2.1.3 引物设计
• 2.2.1.4 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.2.1.5 目的片段的T-A克隆
• 2法）'>2.2.1.6 大肠杆菌感受态的制备（CaCl₂法）
• 2.2.1.7 转化和筛选
• 2.2.1.8 质粒DNA提取
• 2.2.1.9 质粒的鉴定
• 2.2.2 农杆菌介导获得转OS-pme基因水稻植株
• 2.2.2.1 表达载体构建
• 2.2.2.2 农杆菌的培养及转化
• 2.2.2.3 农杆菌介导法转化水稻
• 2.2.2.4 抗性愈伤的GUS染色和抗性小苗总DNA的PCR分析
• 2.2.3 农杆菌介导真空浸润法获得转OS-pme基因拟南芥
• 2.2.3.1 拟南芥生长的条件
• 2.2.3.2 真空浸润法转化拟南芥
• 2.2.3.3 转基因拟南芥的抗性筛选和鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 pme基因的RT-PCR扩增
• 3.2 克隆载体的构建
• 3.3 测序分析
• 3.4 植物转化载体构建
• 3.5 农杆菌介导法转化水稻
• 3.6 转基因水稻抗性愈伤GUS活性检测
• 3.7 转基因拟南芥GUS活性检测
• 3.8 转基因拟南芥PCR验证
• 4 讨论
• 第二节 水稻果胶甲基酯酶基因在大肠杆菌E.coli BL21中的表达
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 载体质粒
• 2.1.3 酶类及其他试剂
• 2.1.4 培养基及常用溶液
• 2.2.实验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.2.3 PCR产物电泳及回收
• 2.2.4 克隆载体构建
• 2.2.4.1 IT-A连接
• 2法）'>2.2.4.2 大肠杆菌感受态的制备（CaCl₂法）
• 2.2.4.3 转化和筛选
• 2.2.4.4 克隆载体DNA的少量提取
• 2.2.5 克隆载体的鉴定
• 2.2.6 表达载体的构建及鉴定
• 2.2.7 表达质粒的诱导表达
• 2.2.7.1 表达质粒转化E.coli BL21（DE3）受体菌
• 2.2.7.2 IPTG的诱导表达
• 2.2.8 表达产物的SDS-PAGE检测
• 2.2.9 Western-blot杂交检测
• 2.2.9.1 蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜
• 2.2.9.2 杂交与检测
• 3.结果与分析
• 3.1 OS-pme基因的PCR扩增结果
• 3.2 克隆载体的构建
• 3.3 表达载体的构建及鉴定
• 3.4 表达产物的SDS-PAGE检测
• 3.5 Western-blot杂交检测
• 4.讨论
• 第三节 水稻果胶甲基酯酶基因在毕赤酵母P.pastoris中分泌表达
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 载体质粒
• 2.1.3 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.2.3 PCR产物电泳及回收
• 2.2.4 T-A连接
• 2.2.5 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.6 转化和筛选
• 2.2.7 质粒DNA的少量提取
• 2.2.8 质粒的鉴定
• 2.2.9 重组表达载体的构建
• 2.2.9.1 重组表达质粒的线性化
• 2.2.9.2 P.pastoris GS115电转感受态的制备
• 2.2.9.3 电击转化
• 2.2.9.4 酵母菌落PCR阳性克隆鉴定
• 2.2.9.5 高G418抗性克隆的筛选
• 2.2.9.6 菌种保存
• 2.2.10 重组酵母的诱导表达和分析
• 2.2.10.1 诱导表达
• 2.2.10.2 SDS-PAGE检测酵母表达蛋白
• 3.结果与分析
• 3.1 OS-pme基因的PCR扩增
• 3.2 克隆载体的构建
• 3.3 表达载体pPIC9K-OS-pme构建
• 3.4 转化毕赤酵母
• 3.5 阳性转化子的筛选和PCR鉴定
• 3.6 多拷贝阳性转化子的筛选
• 3.7 高拷贝数酵母菌株甲醇诱导的表达分析
• 4.讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢