论文摘要
Lyp （Lymphoid-specific tyrosine phosphatase）是由PTPN22编码的非受体型酪氨酸磷酸酶,主要在免疫系统中表达。Lyp由807个氨基酸构成,包括N端300个氨基酸的催化结构域和C端500个氨基酸左右的调节区域构成。当前的研究认为,Lyp可以通过去磷酸化Lck、Fyn、ZAP70等蛋白来负调控T细胞的信号转导。Lyp的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）C1858T使PTPN22在620位的酪氨酸替换为精氨酸（即R620W突变）,携带R620W突变的人群更容易患自身免疫性疾病,包括Ⅰ型糖尿病（Type Ⅰ Diabetes, T1D）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）、风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）、幼年特发性关节炎（juvenile idiopathic arthritis, JIA）（?）Grave’s disease等。虽然R620W一直被认为是功能增进型的突变,但是最近研究显示R620W导致自身免疫病可能由于它在T细胞信号转导过程中的功能缺失。同时有研究表明Lyp催化区域的基因多态性R263Q可以降低SLE、RA和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）勺患病率,但增加肺结（pulmonary tuberculosis,PT）的易感性。遗传学研究还发现在人类中存在其他Lyp的基因多态性,包括S20lF,R266W等,其中S201F和R266W不增加Ⅰ型糖尿病的患病风险。为进一步分析这些基因多态性对Lyp生化性质和功能的影响,我们检测了Lyp基因多态性S201F、R263Q和R266W对小分子底物,磷酸多肽底物和蛋白底物的磷酸酶活力；以及这些突变导致Lyp在T细胞信号转导途径和免疫应答中功能的变化。本实验结果说明Lyp的S201F突变虽然改变了Lyp对小分子底物的催化活力,但其对磷酸多肽底物和蛋白底物的活力影响甚小,并对Lyp在T细胞中的功能产生较小的影响。Lyp的R263Q和R266W突变显著减低了其对磷酸多肽底物的活力,并减弱了Lyp对T细胞免疫应答的抑制作用。这些结果预示除R263Q可减低一些自身免疫性疾病的风险外,R266W基因多态性也可能通过影响Lyp的功能而对自身免疫性疾病易感性产生影响。[研究目的]研究淋巴组织特异酪氨酸磷酸酶（Lyp）的不同突变（S201F、R263Q和R266W的生化特性和细胞功能。[研究方法]1.生化特性（1）用PrimerX软件设计引物,以PET-16b-Lyp-CD-His-wild type为模板用QuikChange的方法构建不同突变的Lyp的质粒：3201F, R263Q, R266W。（2）在BL21大肠杆菌中过表达Lyp催化区域的蛋白（wild type, S201F, R263Q,R266W）,通过Ni2+-NTA柱和CM阳离子交换柱纯化,以获得可以进行生化分析的高纯度蛋白。（3）用纯化的蛋白进行酶动力学研究：1）检测Lyp不同突变对小分子底物pNPP磷酸酶活力。2)检测Lyp不同突变对含有磷酸化酪氨酸的9个氨基酸短肽pLck394的磷酸酶活力。3)体外纯化Src蛋白,用western blotting检测Lyp不同突变对其416位点的磷酸酶活力。4)比较Lyp wild type和R266W在pH值4-8.7时对pNPP的磷酸酶活力。2.细胞功能用电转的方法将质粒（pcDNA4-Lyp-CD-mycHis-wild type, F201, Q263W266）转染Jurkat T细胞,培养细胞48小时后用培养基（对照）和anti-CD3刺激,用特异性的抗体检测野生型和各突变对ERK和Lck394磷酸化水平的影响,比较Lyp不同突变T细胞信号转导途径中磷酸化水平的影响。[研究结果]1.生化特性（1）质粒构建成功。（2）通过Ni2+-NTA柱和CM阳离子交换柱,Lyp wild type, S201F, R263Q和R266W的蛋白纯度都可以达到95%以上。（3）酶动力学研究：1)对小分子底物pNPP的磷酸酶活力：Kcat/Km值可以反映磷酸酶活力的大小Q263的Kcat/Km值与WT相比,差别没有统计学意义（P>0.05）。Lyp的S201F,R266W的Kcat/Km值与野生型相比,分别降低了50%和80%。2)对含有磷酸化酪氨酸的9个氨基酸短肽pLck394磷酸酶活力：F201,Q263,W266的Kcat/Km值与野生型相比,分别降低了20%,40%和60%。3)对体外纯化Src蛋白的磷酸酶活力：反应5分钟,Lyp野生型可以使Src蛋白的416位酪氨酸磷酸化水平降低50%。Lyp的F201和Q263分别需要10分钟和30分钟使Src蛋白的416位酪氨酸磷酸化水平降低50%。而W266的活力显著降低,反应30分钟才能Src蛋白的416位酪氨酸磷酸化水平降低20%。4)在不同的pH值下测Lyp野生型和W266对小分子底物pNPP的酶活变化,计算出酶限速反应阶段的解离常数pKb （wild type R266=6.54, W266=6.01）。2.细胞功能野生型Lyp和三个突变能不同程度的影响T细胞内Lck和ERK的水平。抑制T细胞的能力：wild type) F201>Q263> W266。[结论]F201降低了Lyp磷酸酶活力,但对Lyp在T细胞信号转导中的作用基本无影响,而Q263、W266相比野生型的磷酸酶活力明显减弱,明显减弱了其对T淋巴细胞的免疫响应的抑制作用,因此称之为功能缺陷型突变。Q263由于功能缺失可以降低自身免疫性疾病的患病率,W266也可能降低某些自身免疫性疾病的患病率。抑制Lyp的磷酸酶活力可以作为治疗自身免疫性疾病的有效方法。
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