论文摘要
本课题前期采用酵母双杂交系统筛选成人肝文库,得到Keap1可能与p65蛋白发生相互作用,因此本课题的主要目的是对Keap1与p65蛋白相互作用的真实性进行验证,并探索其相互作用的分子机制及其生物学意义。第一章Keap1与p65蛋白相互作用的验证目的:验证Keap1与p65蛋白相互作用的真实性。方法:采用酵母回转、免疫共沉淀、荧光共定位技术分别验证Keap1与p65蛋白在酵母细胞、真核细胞中的相互作用,并初步探讨其相互作用的结构域。结果:酵母回转验证Keap1与p65蛋白相互作用为阳性结果;免疫共沉淀证实Keap1与p65蛋白在真核细胞中存在相互作用;荧光共定位技术确定静息状态下及TNFα刺激下Keap1与p65能够共定位于细胞质。免疫共沉淀方法发现Keap1与p65的相互作用需要Keap1的全长。结论:Keap1与p65蛋白在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在特异性相互作用。第二章Keap1与p65蛋白相互作用对NF-κB信号通路的影响目的:探索Keap1与p65蛋白相互作用对NF-κB信号通路的影响。方法:采用双荧光素酶报告基因系统分析多种条件下,外源性Keap1的转入对p65转录活性的影响,采用免疫印迹方法分析Keap1对p65蛋白翻译水平的影响。结果:无论在静息状态下还是在多种应激状态下,Keap1均未能对p65的转录活性和翻译水平产生影响。结论:未发现Keap1与p65蛋白相互作用对NF-κB信号通路的影响。第三章Keap1与p65蛋白相互作用对Keap1-Nrf2-ARE信号通路的影响目的:探索Keap1与p65蛋白相互作用对Keap1-Nrf2-ARE信号通路的影响。方法:采用双荧光素酶报告基因系统,探索p65蛋白是否影响Nrf2转录因子的转录活性。结果:实验发现p65能抑制Nrf2的转录活性,并能增强Keap1对Nrf2转录活性的抑制。在静息或活化状态下,p65、Keap1、以及p65与Keap1的复合物均能抑制Nrf2对NQO1启动子的反式激活作用。结论: Keap1与p65蛋白相互作用能增强Keap1对Nrf2转录活性的抑制。第四章p65增强Keap1对Nrf2转录活性抑制的分子机制目的:探索p65增强Keap1对Nrf2转录活性抑制的分子机制。方法:采用间接免疫方法,用激光共聚焦显微镜观察p65是否调控Keap1的核转位;采用半定量RT-PCR检测p65是否增强Keap1的转录水平;采用蛋白稳定性实验探索p65是否增强Keap1蛋白的稳定性。结果:静息状态和TNFα刺激条件下,p65不能调控Keap1的核转位;p65对Keap1的转录水平无显著影响;p65可以增强Keap1的蛋白稳定性。结论:p65有可能是通过增强Keap1的蛋白稳定性,进而增强Keap1对Nrf2的转录活性的抑制作用。第二部分Mayven不同截短体原核表达载体的构建、表达和纯化目的:拟采用GST-Pull down联合质谱鉴定技术寻找Mayven的相互作用蛋白,探索Mayven蛋白在多发性硬化症中的作用,为多发性硬化症的治疗提供线索。方法:首先构建Mayven不同截短体的原核表达载体,并探索诱导条件,使之在原核系统中呈可溶性表达,纯化Mayven不同截短体所表达的蛋白。结果:构建的这些载体测序正确并能够在原核系统中呈可溶性表达,初步纯化了各截短体表达的蛋白。结论:成功构建了Mayven不同截短体的原核表达载体,并得到了初步纯化的各截短体表达蛋白,为后续寻找Mayven的相互作用蛋白,探索Mayven蛋白在多发性硬化症中的作用提供了线索。
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标签：蛋白蛋白相互作用论文; 信号通路论文; 作用机制论文; 原核表达论文; 纯化论文;