论文摘要
前言细胞因子信号通路抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3）是SOCS家族成员之一,能够阻断细胞因子应答并负反馈调节STAT3信号通路,在抑制细胞过度生长、诱导凋亡、维持细胞内环境稳态等方面具有重要作用。SOCS3在多种肿瘤中表达下调,与恶性肿瘤的发生发展关系密切。研究表明,基因启动子区高度甲基化导致SOCS3表达沉默是头颈部鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤和Barrett’s腺癌等多种肿瘤形成的重要原因之一。与基因启动子区异常甲基化相关的SOCS3表达沉默最终导致肝癌细胞的增殖和迁移能力显著增强,证实SOCS3对STAT3和FAK信号通路均具有调节作用。因此目前认为SOCS3可能对于恶性肿瘤的发生发展具有抑制作用。然而Bellezza等研究发现SOCS3表达于前列腺癌组织,其基因启动子区并未发生异常甲基化,不表达或弱表达于前列腺良性病变,特异性siRNA下调SOCS3表达后可以抑制肿瘤细胞增殖并增加凋亡率。目前推测SOCS3表达上调可能阻断某些肿瘤细胞对抑制肿瘤生长的细胞因子发生应答,间接起到保护作用。SOCS3蛋白在结构上含有3个不同功能区,包括一个N-末端激酶抑制区（KIR）,一个中心SH2区和一个C-末端SOCS-box结构。SOCS3蛋白的SH2和KIR区能够与磷酸化的酪氨酸残基相互作用,从而负性调节酪氨酸激酶的活性。SOCS3蛋白的SOCS-box连接SOCS3-SH2区相互作用的靶蛋白和E3泛素连接酶,通过泛素化和蛋白酶体介导的降解途径调节细胞中靶蛋白水平。脯氨酸丰富的酪氨酸激酶2（Proline-rich tyrosine kinase 2,PYK2）属于FAK家族,是一种非受体酪氨酸激酶,在细胞内分布广泛,与细胞内多种信号传导通路及其生物学功能密切相关,调节细胞存活、增殖和迁移。胚胎早期几乎检测不到PYK2的表达,然而来自PYK2基园敲除胚胎的巨噬细胞表现出明显的迁移和功能缺陷。相反,PYK2信号通路的活化能够增强细胞运动并促进细胞非锚定状态下的存活。很多研究小组发现高侵袭力的肿瘤细胞中PYK2蛋白表达上调和/或活性增强。目前对PYK2的研究主要集中于病理生理条件下其多个磷酸化位点活性的变化及其对下游靶蛋白的磷酸化作用。其中酪氨酸402位点（Tyr402）是PYK2最重要的自身磷酸化位点,为PYK2活化和功能所必需,其磷酸化后可以增强乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力,可能在促进肿瘤转移方面具有重要作用。某些受体酪氨酸激酶与其相应配体结合后诱导Tyr402磷酸化,并结合含有SH2结构域的蛋白,如Src激酶。PYK2-Src双重激酶复合物进一步使某些细胞骨架相关蛋白磷酸化而活化,并激活下游的信号传导通路,如MAPK途径,从而调节细胞存活、增殖和运动。在对肝癌组织的研究发现,PYK2高表达的患者多属肝癌晚期,而且动物实验显示在侵袭边缘的肿瘤细胞和肺转移结节中均发现PYK2过表达。然而PYK2广泛表达于正常胃粘膜,但在胃癌组织中表达显著降低,而且胃癌组织学分级和TNM分期越高,PYK2表达越低。这表明PYK2蛋白在不同肿瘤中的表达具有差异,对于不同肿瘤的发生发展可能具有不同作用。在对肺癌的研究发现,PYK2是悬浮生长介导的肺腺癌细胞存活和神经肽诱导的肺小细胞癌细胞增殖信号通路的关键效应分子。SOCS3和PYK2与肿瘤的关系正日益受到关注,但目前还没有关于SOCS3和PYK2在NSCLC中表达和相互关系的文献报道。本研究目的旨在探讨NSCLC组织中SOCS3和PYK2的表达及其临床意义,分析SOCS3基因甲基化状态与其蛋白表达的关系,以及PYK2表达和磷酸化与NSCLC细胞系转移潜能的关系。并在细胞水平上,应用去甲基化试剂和SOCS3突变体处理A549细胞,探讨SOCS3蛋白表达上调对PYK2及Tyr402和ERK1/2磷酸化水平,以及A549细胞迁移能力的影响,为SOCS3蛋白可能是PYK2信号通路非常重要的负性调节因子提供依据。材料与方法NSCLC组织标本:90例组织标本均来自中国医科大学病理教研室。患者术前均未接受过任何化学或放射治疗。福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片常规进行HE染色,分别由两名病理诊断医师,根据WHO肺及胸膜肿瘤分类标准（2004）和TNM分期系统（1997）,确定肿瘤的组织学分型以及临床病理分期。90例NSCLC包括:鳞癌48例,腺癌42例;高分化37例,中低分化53例;肿瘤直径＜5cm者60例,≥5cm者30例;临床病理分期显示Ⅰ期12例,Ⅱ期23例,Ⅲ期55例;淋巴结转移48例,无淋巴结转移42例。30例（包括在90例内）配对的NSCLC和癌旁肺组织（远离原发灶）在液氮中快速冰冻,以后用于提取蛋白和DNA。常规病理检查手术切除的肺门、纵隔以及肺内淋巴结,用于确定肺癌的淋巴结转移情况。患者的临床病理参数包括肿瘤大小、组织学类型、分化程度、临床病理分期和淋巴结转移,摘自患者的病历资料。NSCLC细胞培养和处理:肺巨细胞癌（PG）细胞系,包括高转移潜能的BE1细胞（成瘤率100%,转移率94%）和低转移潜能的LH7细胞（成瘤率100%,转移率50%）,由郑杰教授惠赠（北京大学病理学系）。BE1、LH7和HBE细胞用RPMI 1640培养基培养,A549细胞用DMEM培养基培养（均购自Gibco,InvitrogenCorporation,USA）,添加10%胎牛血清,100U/ml青、链霉素和NaHCO3,5%CO2、37℃条件下培养。细胞培养至亚融合状态时提取蛋白。细胞实验均重复3次。SOCS3蛋白的SH2区、KIR区和SOCS-box缺失突变体由Dr.Kristiina Vuori（The BurnhamInstitute,CA,USA）惠赠。SOCS3表达恢复实验应用10μM5-aza-2’-deoxycytidine（Sigma）处理细胞,隔天换液,6d后收集细胞,提取蛋白和DNA。Lipofectamine2000（Invitrogen）用于细胞转染实验,A549细胞生长至80-90%融合时,3种SOCS3蛋白突变体和pcDNA3空载体转染细胞48h。25μM蛋白酶体抑制剂β-lactacystin（Santa Cruz）预处理转染SOCS3-KIR突变体细胞并维持至实验结束。甲基化特异性PCR:MSP方法如文献所述,Wizard DNA Clean-up System（Promega）纯化修饰后的DNA。应用Methyl Primer Express v1.0（ABI）软件针对SOCS3基因设计甲基化和非甲基化特异性引物。SOCS3基因第2外显子区甲基化特异性引物序列为:5’-TTC GAG GTG TTC GAG TAG TC-3’（上游）和5’-AACGAT CTT CCG ACA AAA AT-3’（下游）;非甲基化特异性引物序列为:5’-TTT TTTGAG GTG TTT GAG TAG TT-3’（上游）和5’-AAC AAT CTT CCA ACA AAA ATA CT-3’（下游）,扩增产物长度均为159bp。反应在G-Storm PCR仪上进行,反应体系为25μl,含3μl DNA模板,上、下游引物各1μl,TaqMix（Tiangen）12.5μl,ddH20 7.5μl。同时设立阳性和阴性对照。PCR循环条件为:95℃预变性10min,95℃40s,63℃40s（甲基化扩增）和62℃40s（非甲基化扩增）,72℃40s,40个循环后,72℃延伸10min。取5μl PCR产物用于2%琼脂糖电泳。RT-PCR:Trozol（Invitrogen）提取细胞总RNA。应用Reverse TranscriptaseM-MLV（Takara）逆转录生成cDNA,PCR扩增PYK2,同时扩增β-actin作为内参。PYK2引物序列为:5’-AGATTCCCGACGAAACCC-3’（上游）和5’-CACGGCGAACATCCAGAC-3’（下游）,产物长度为629bp;内参β-actin引物序列为:5’-AAATCGTGCGTGACATTAA-3’（下游）和5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’（下游）,产物长度为455bp。反应在G-Storm PCR仪上进行,反应体系为25μl,含2μl DNA模板,上、下游引物各1μl,TaqMix（Tiangen）12.5μl,ddH2O 8.5μl。PYK2 PCR循环条件为:95℃预变性5min,95℃40s,54℃40s,72℃40s,35个循环后,72℃延伸5min。内参β-actin PCR循环条件为:95℃预变性5min,95℃40s,50℃40s,72℃40s,30个循环后,72℃延伸5min。取5μl PCR产物用于2%琼脂糖电泳。EC3 Imaging System（UVP Inc.,USA）凝胶成像系统采集图像,Image J软件用于半定量分析特异性条带的光密度值,将PYK2与β-actin光密度比值作为其mRNA的相对表达量。实验至少重复3次,取平均值。Western blot和免疫共沉淀:采用含有PMSF和磷酸酶抑制剂混合物的M-PER（PIERCE）蛋白提取试剂提取细胞蛋白,考马斯亮蓝法检测蛋白浓度,上样总蛋白为80μg,8%和12%SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭,一抗4℃孵育过夜,二抗IgG 37℃孵育2h,最后DAB显色。本研究中以下抗体用作一抗:小鼠单克隆抗-c-myc标签（Applygen）,兔多克隆抗-SOCS3,抗-PYK2,抗-Tyr402,抗-ERK1/2和抗-β-actin（Santa Cruz）。EC3 Imaging System（UVPInc.,USA）凝胶成像系统采集图像,Image J软件用于半定量分析特异性条带的光密度值,将目的蛋白与β-actin光密度比值作为相对表达量。实验至少重复3次,取平均值。采用Profound mammalian c-myc tag IP/Co-IP免疫沉淀试剂盒（PIERCE）检测转染的SOCS3突变体与细胞内PYK2的相互作用。实验按照试剂盒说明进行,抗-c-myc标签抗体沉淀后的细胞裂解产物再用抗-PYK2抗体进行western blot分析。实验至少重复3次。Transwell细胞迁移实验:采用Transwell小室（Costar）测定细胞迁移能力。5-aza-2’-deoxycytidine处理A549细胞6天后,将1×104个细胞接种在包被Matrigel的膜上并继续培养12h。SOCS3蛋白突变体转染A549细胞48h后,同样将1×105个细胞接种在膜上并继续培养12h。下层小室加入DMEM完全培养基。用棉签小心擦去膜上表面未发生迁移的细胞,迁移至膜下表面的细胞经4%多聚甲醛固定后用苏木素染色。随机选取5个高倍视野计数迁移细胞数。实验至少重复3次,取平均值。免疫组化染色SP法:90张NSCLC组织切片常规脱蜡并水化。染色步骤简述如下:0.1mol/L Tris-HCl（pH 10.0）缓冲液,高温高压修复抗原2.5min;3%H2O2和5%山羊血清37℃下分别孵育切片1h;兔抗人一抗4℃孵育过夜;山羊抗兔IgG和SP复合物37℃分别孵育切片30min;最后DAB显色,苏木素复染细胞核。同时设立阳性和阴性对照。统计学分析:SPSS 13.0统计学软件用于数据分析及处理。western blot结果应用t检验比较NSCLC和癌旁肺组织中蛋白表达水平的差异,Pearson相关分析用于评价NSCLC和癌旁肺组织中SOCS3表达与基因甲基化的关系。免疫组化结果应用x2检验对蛋白表达与临床病理特征之间的关系进行分析。P＜0.05视为有统计学意义,P＜0.01认为差异显著。实验结果非小细胞肺癌组织中SOCS3的表达与基因甲基化的关系:90例NSCLC组织中,癌旁和部分癌细胞中可见SOCS3蛋白表达。在癌旁肺组织中,SOCS3表达于支气管粘膜上皮和肺泡上皮细胞。我们观察到41例（45.6%）NSCLC组织SOCS3阳性表达（每高倍视野多于5%肿瘤细胞阳性）,49例（54.4%）NSCLC组织SOCS3阴性表达。此外SOCS3蛋白表达在NSCLC主要组织学类型肺鳞癌和腺癌（P=0.101）以及分化程度（高分化vs中低分化,P=0.219）之间,没有统计学差异。统计学分析表明,体积较小（T＜5cm vs T≥5cm,P=0.036）,无淋巴结转移（阳性vs阴性,P=0.039）和Ⅰ+Ⅱ期（Ⅰ+ⅡvsⅢ,P=0.028）NSCLC组织中SOCS3阳性表达率较高。30例癌旁肺组织均检测到SOCS3蛋白表达,NSCLC组织中SOCS3的表达低于癌旁肺组织,其中淋巴结转移组SOCS3的表达低于无淋巴结转移组。统计学分析结果表明,NSCLC和癌旁肺组织中SOCS3表达的平均灰度值分别为26.3±12.3和78.4±14.5,二者比较有明显的统计学差异（P=0.000）。淋巴结阳性和阴性组中SOCS3表达的平均灰度值分别为22.8±12.4和33.4±8.7,二者比较有统计学意义（P=0.023）。统计学分析显示,SOCS3在NSCLC组织中表达下调,而且淋巴结阳性的NSCLC组织中SOCS3表达水平较低。30例NSCLC组织有20例（66.7%）检测到SOCS3基因异常甲基化,而癌旁肺组织只有4例（13.3%）检测到SOCS3基因异常甲基化。出现完全甲基化的SOCS3蛋白表达下调或缺失。统计学结果显示,甲基化阴性组SOCS3表达水平高于甲基化阳性组（平均灰度值分别为34.1±9.1和22.5±12.0）,SOCS3蛋白水平与基因甲基化负相关（r=-0.454,P=0.012）。因此SOCS3基因异常甲基化可能是SOCS3蛋白表达水平下调或缺失的原因之一。非小细胞肺癌组织中PYK2的表达和NSCLC细胞系中PYK2的表达和磷酸化与NSCLC细胞转移潜能的关系:30例NSCLC组织中PYK2的表达高于癌旁肺组织,其中淋巴结转移组PYK2的表达高于无淋巴结转移组。统计学分析表明,NSCLC和癌旁肺组织中PYK2表达的平均灰度值分别为75.1±7.7和42.4±9.1,二者比较具有显著的统计学差异（P＜0.001）。淋巴结阳性和阴性组中PYK2表达的平均灰度值分别为78.2±8.0和72.4±6.5,二者比较有统计学意义（P=0.035）。统计学分析显示,PYK2在NSCLC组织中表达上调,而且淋巴结阳性的NSCLC组织中PYK2表达水平较高。我们发现人支气管上皮细胞系（HBE）弱表达PYK2蛋白,Tyr402位点磷酸化水平较低;PYK2的表达和磷酸化水平在NSCLC细胞系高于HBE细胞系,不同转移潜能的肺巨细胞癌细胞系高于不转移的肺腺癌A549细胞系,高转移潜能的BE1细胞系高于低转移潜能的LH7细胞系。HBE、A549、LH7和BE1细胞系中PYK2蛋白表达的平均灰度值分别为23.6±2.5、57.2±2.6、73.6±7.0和114.2±13.8;Tyr402位点磷酸化条带的平均灰度值分别为0、66.7±5.9、85.8±9.0和120.7±14.3。统计学分析表明,4种细胞系之间两两比较,PYK2蛋白表达和磷酸化水平的差异均具有统计学意义（P＜0.05）。这些结果表明,PYK2高表达和Tyr402位点的高度磷酸化与NSCLC细胞系的转移潜能相关。在癌旁和癌组织中均可见PYK2蛋白阳性表达。在癌旁肺组织中,PYK2表达于支气管粘膜上皮、粘膜下腺上皮以及肺泡上皮细胞（少于50%上皮细胞弱着色,评分≤3,呈低表达）。我们还发现某些NSCLC间质中的内皮细胞也有PYK2表达。90例NSCLC组织均有不同程度的PYK2表达。我们观察到58例（64.4%）NSCLC组织呈PYK2高表达（多于50%肿瘤细胞强着色,评分＞3）。同时我们对PYK2表达与临床病理参数之间的关系进行了统计学分析。我们发现NSCLC淋巴结转移组中PYK2高表达率显著高于无淋巴结转移组（P=0.007）,PYK2在Ⅲ期肺癌中高表达率高于Ⅰ+Ⅱ期（P=0.012）。PYK2的表达在肺癌两种最主要的组织学类型鳞癌和腺癌之间没有统计学差异（P=0.083）。而且PYK2高表达与肿瘤大小（T＜5cm vs T≥5cm,P=0.436）和分化程度（高分化vs中低分化,P=0.605）均无关。PYK2的表达与活化以及ERK1/2磷酸化与A549细胞的迁移能力相关:我们对A549和HBE细胞中PYK2蛋白表达和代表PYK2活化的酪氨酸402位点磷酸化水平,以及ERK1/2磷酸化水平进行了比较。作为A549细胞的正常对照,HBE细胞中PYK2蛋白水平较低,而且未检测到Tyr402位点磷酸化。同时在HBE细胞中也观察到低水平磷酸化的ERK1/2。A549细胞表达较高水平的PYK2蛋白,同时Tyr402和ERK1/2的磷酸化水平也较高。此外,Transwell细胞迁移实验表明12h时迁移至下层小室的A549细胞数（16.9±3.6）显著多于HBE细胞（7.9±1.9,P=0.000）。因此,我们认为PYK2的表达和磷酸化与A549细胞的迁移能力相关,ERK1/2可能参与调节A549细胞迁移的信号传导过程。A549细胞中SOCS3表达下调与基因甲基化相关:我们应用western blot方法对A549和HBE细胞中SOCS3蛋白表达水平进行比较发现,A549细胞中SOCS3蛋白水平显著低于HBE细胞。由于多种人类肿瘤中SOCS3表达下调与其基因异常甲基化相关,因此我们应用甲基化和非甲基化特异性引物,分别检测SOCS3基因第1外显子区,第1内含子区和第2外显子区的DNA甲基化状态。在A549细胞中我们检测到SOCS3基因第2外显子区DNA异常甲基化,而非编码的第1外显子区和第1内含子区均未检测到甲基化。同时,在HBE细胞中未检测到SOCS3基因甲基化。这表明A549细胞中SOCS3蛋白表达下调与其基因第2外显子区甲基化相关。同时去甲基化试剂5-aza-2’-deoxycytidine作用于A549细胞后,检测到甲基化特异性条带缺失,并出现非甲基化扩增。进一步表明A549细胞中存在着SOCS3基因甲基化。SOCS3蛋白再表达抑制A549细胞迁移:为了探讨SOCS3蛋白对于A549细胞迁移的影响,我们对去甲基化试剂5-aza-2’-deoxycytidine处理前后细胞的迁移进行了比较。5-aza-2’-deoxycytidine处理前后A549细胞的迁移细胞数分别为16.9±3.6和9.2±3.4（P=0.000）。5-aza-2’-deoxycytidine处理后,SOCS3蛋白表达增加,而A549细胞的迁移受到抑制。我们进一步发现5-aza-2’-deoxycytidine处理后A549细胞中PYK2和ERK1/2的磷酸化水平均降低,而Tyr402磷酸化水平的降低可能由于PYK2蛋白水平降低。因此,SOCS3蛋白可能通过下调PYK2抑制A549细胞迁移。RT-PCR结果显示,5-aza-2’-deoxycytidine处理前后,A549细胞中PYK2的mRNA水平无变化。为了进一步明确A549细胞迁移能力的降低是否由于蛋白酶体介导的PYK2蛋白的降解,我们应用不可逆的蛋白酶体抑制剂,β-lactacystin同时处理A549细胞,发现PYK2蛋白水平增加,而且迁移至下层小室的A549细胞数也增加（12.9±3.2,P=0.008）。这些结果表明,SOCS3蛋白再表达抑制A549细胞迁移可能与蛋白酶体介导的PYK2蛋白的降解相关。SOCS3突变体转染对于PYK2和ERK1/2的磷酸化以及A549细胞迁移的影响:我们应用A549细胞研究外源表达的SOCS3突变体对于PYK2和ERK1/2磷酸化和细胞迁移的作用。A549细胞中能够检测到由c-myc标签蛋白代表的外源表达的SOCS3功能区缺失突变体。空载体和SOCS3-SH2缺失突变体转染的A549细胞的迁移细胞数分别为16.1±3.8和15.7±3.5,两组比较没有差异（P=0.725）。转染细胞中,PYK2蛋白水平,Tyr402和ERK1/2的磷酸化水平与空载体转染细胞的相似,无统计学意义（P＞0.05）。结果表明外源表达的SOCS-SH2缺失突变体可能对于A549细胞的迁移能力没有影响。在SOCS3-KIR区缺失突变体转染的A549细胞中,PYK2和ERK1/2的磷酸化水平降低,A549细胞迁移受到抑制。空载体和SOCS3-KIR突变体转染的A549细胞的迁移率分别为16.1±3.8和10.3±2.9,二者比较有显著差异（P=0.000）。表达KIR区缺失的SOCS3蛋白的细胞显示PYK2蛋白水平下降而mRNA水平无变化,β-lactacystin预处理后PYK2蛋白水平在一定程度上恢复,迁移至下层小室的A549细胞数也增加（13.1±3.9,P=0.007）。这些结果表明,外源表达的SOCS3抑制A549细胞迁移可能与蛋白酶体介导的PYK2蛋白的降解相关。在转染SOCS-box缺失突变体蛋白的A549细胞中发现,空载体和SOCS-box缺失突变体转染的A549细胞的迁移细胞数分别为16.1±3.8和13.8±4.5（P=0.227）。Tyr402和ERK1/2磷酸化水平略低于空载体转染组,但转染细胞中PYK2蛋白水平与对照组相似。结果显示SOCS-box缺失的SOCS3蛋白不能降低PYK2蛋白水平,或显著抑制A549细胞迁移。因此SOCS-box可能是SOCS3介导的降低PYK2蛋白水平和A549细胞迁移能力所必需的。A549细胞中外源表达的SOCS3突变体与PYK2蛋白的相互作用:我们进一步探讨了A549细胞中外源表达的SOCS3突变体与PYK2蛋白之间的相互作用。我们检测到PYK2与外源表达的c-myc标签蛋白形成免疫共沉淀产物,代表转染的SOCS-box缺失突变体与PYK2具有相互作用。然而,SOCS3-SH2或-KIR区缺失突变体转染A549细胞后均未检测到与PYK2形成免疫共沉淀产物。这些结果表明,SH2和KIR区对于SOCS3蛋白与PYK2相互作用非常重要,而且SOCS3/PYK2功能复合体的形成与抑制A549细胞迁移作用相关。讨论SOCS3负反馈调节细胞因子信号通路,通常通过抑制JAK/STAT信号途径参与调节多种生物学功能。SOCS3基因敲除后导致肝细胞中STAT3持续活化,促进细胞增殖并抑制凋亡,与肝炎诱导的肝癌发生有关。创伤愈合过程中SOCS3通过抑制STAT3磷酸化负性调节PDGF诱导的成纤维细胞迁移。免疫组化结果显示,癌旁肺组织中SOCS3表达于支气管粘膜上皮和肺泡上皮细胞,提示SOCS3蛋白表达可能有助于维持正常肺支气管和肺泡上皮细胞的生长和功能。目前有关SOCS3在肿瘤组织中表达的报道还比较少,Krishnadasan等研究发现,SOCS3过表达于新生滤泡性淋巴瘤组织,并与患者的生存期下降有关,可以作为判断患者预后的独立危险因素。有关SOCS3在NSCLC和癌旁肺组织中表达水平的研究还没有文献报道。本研究应用western blot方法比较了30例NSCLC和癌旁肺组织中SOCS3蛋白表达水平的差异。结果显示NSCLC组织中SOCS3蛋白表达水平显著低于癌旁肺组织,二组间差异有显著的统计学意义。同时免疫组化结果也显示SOCS3在癌旁肺组织中均为阳性表达,在部分NSCLC组织中有表达,其中41例NSCLC为阳性表达（45.6%）。结果表明SOCS3在NSCLC组织中表达下调,与Krishnadasan等报道的SOCS3在新生滤泡性淋巴瘤组织中的表达不一致,这可能由于SOCS3在不同肿瘤组织中的作用不同。SOCS3蛋白表达下调可能与NSCLC的发生有关。抑癌基因、细胞周期调节基因以及信号传导抑制基因异常甲基化发生在多种肿瘤或癌前病变,基因高度甲基化导致SOCS3表达沉默,与肿瘤的发生发展关系密切。去甲基化试剂使SOCS3表达恢复后可显著抑制STAT3和FAK磷酸化,诱导细胞凋亡,阻断细胞迁移。为了探讨SOCS3在NSCLC组织中表达下调或缺失是否由于基因异常甲基化引起,我们应用甲基化特异性PCR方法检测了SOCS3基因甲基化状态。结果表明SOCS3蛋白表达下调或缺失与基因异常甲基化相关,甲基化可能是SOCS3表达下调或缺失的主要原因。Tokumaru等研究认为,SOCS3通过STAT3信号通路抑制角质细胞运动,Niwa等发现SOCS3也能通过FAK信号通路抑制肝癌细胞迁移。因此我们进一步对SOCS3表达与NSCLC患者临床病理参数之间的关系进行统计学分析发现,淋巴结转移组SOCS3阳性表达率为35.4%（17/48）,而无淋巴结转移组SOCS3阳性表达率为57.1%（24/42）,二组间差异有统计学意义。结果表明随着NSCLC淋巴结转移,SOCS3阳性表达率降低。结合肿瘤大小和TNM分期,我们还发现SOCS3阳性表达率随着NSCLC体积的增大和TNM分期的增加而降低,差异有统计学意义。这提示我们SOCS3可能与NSCLC的发展有关,但还需要对涉及的信号传导通路进一步研究。综上所述,本研究观察到SOCS3在癌旁肺组织中均为阳性表达,在NSCLC组织中表达下调或缺失,与SOCS3基因异常甲基化有关。而且SOCS3阳性表达率随着NSCLC淋巴结转移和TNM分期的增加而降低。这提示我们由于基因异常甲基化导致的SOCS3表达沉默可能是NSCLC发生发展的重要机制之一。对于SOCS3基因去甲基化研究,恢复内源性SOCS3蛋白表达将有助于为NSCLC的治疗提供新的方向和思路。SOCS3蛋白在NSCLC中的调节机制有待于进一步细胞水平上的研究。PYK2是一种非受体酪氨酸激酶,多种细胞外刺激均能激活PYK2。PYK2在不同类型的细胞中与不同的信号分子相互作用,参与调节多种细胞生物学功能。PYK2调节AngⅡ对大鼠星形胶质细胞的促进生长作用,参与整合素介导的细胞伸展和迁移过程,PYK2也能调节表皮角质细胞的分化。免疫组化结果显示癌旁肺组织中支气管上皮、粘膜下腺上皮和肺泡上皮细胞有PYK2低表达,提示PYK2低水平表达可能有助于维持正常细胞的生长和分化。目前研究有关PYK2在肿瘤组织中表达的报道还比较少,Sun等研究表明,PYK2广泛表达于肝细胞癌组织,而且肝癌组织体积越大、Edmonson分级越高,PYK2表达水平越高。关于PYK2在NSCLC和癌旁肺组织中表达水平的研究还没有文献报道。本研究应用western b1ot方法比较了30例NSCLC和癌旁肺组织中PYK2蛋白表达水平的差异。结果显示NSCLC组织中PYK2蛋白表达水平显著高于癌旁肺组织,二组间差异具有显著的统计学意义。同时免疫组化结果也显示PYK2蛋白在NSCLC组织中均有表达,其中58例NSCLC为高表达（64.4%）,而癌旁肺组织中PYK2均为低表达。我们的研究结果与Sun等报道的PYK2在癌旁肝组织和肝癌组织中的表达类似。结果提示PYK2蛋白过表达可能与NSCLC的发生有关。我们进一步对PYK2高表达与NSCLC患者临床病理参数之间的关系进行统计学分析发现,淋巴结转移组PYK2高表达率为77.1%（37/48）,而无淋巴结转移组PYK2高表达率为50%（21/42）,二组间差异具有显著的统计学意义。结果提示随着NSCLC出现淋巴结转移,PYK2表达也逐渐增强。结合NSCLC患者的TNM分期,我们发现PYK2高表达率随着TNM分期的增高也逐渐增加,差异具有统计学意义。这提示我们PYK2可能与NSCLC的发展有关。Zrihan等曾报道,PYK2蛋白磷酸化尤其是402位点酪氨酸残基（Tyr402）的磷酸化与乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力相关。因此我们应用western blot方法对人支气管上皮细胞（HBE）和不同转移潜能的NSCLC细胞中PYK2的表达和Tyr402位点的磷酸化水平进一步检测发现,PYK2在HBE细胞中低表达,磷酸化水平也较低。PYK2的表达和磷酸化水平随着NSCLC细胞系转移潜能的增强而逐渐增加。高转移潜能的BE1细胞中PYK2过表达同时伴有Tyr402位点的高度磷酸化,这提示我们PYK2过表达及其Tyr402位点的磷酸化状态与NSCLC细胞的转移潜能有关。Tang等发现PYK2蛋白具有促进肺血管内皮细胞伸展及迁移的作用,Kuwabara等也发现PYK2的激酶活性可以增强内皮细胞的迁移能力,从而导致血管发生以及新生血管的形成。免疫组化结果也显示PYK2高表达于某些NSCLC肿瘤间质中的内皮细胞,而这些NSCLC均已发生淋巴结转移。PYK2是否能够通过诱导淋巴管新生,从而促进NSCLC淋巴结转移还有待于进一步研究。综上所述,本研究观察到PYK2在癌旁肺组织中低表达,但PYK2在NSCLC组织中的表达显著上调,而且随着NSCLC淋巴结转移和TNM分期的增高而逐渐增强,同时也发现PYK2过表达和Tyr402位点的磷酸化状态与NSCLC细胞的转移潜能相关。这提示我们,PYK2可能在NSCLC的发生发展过程中起着重要作用。然而PYK2蛋白在NSCLC中的调节机制仍需要细胞水平上的研究。尽管已有大量关于PYK2下游信号通路的研究,但是有关PYK2的调节机制目前尚不明确。我们的研究表明SOCS3蛋白可能具有负性调节PYK2的作用。在多种人类恶性肿瘤中,基因启动子区甲基化导致SOCS3蛋白表达下调,其转录沉默与恶性肿瘤的生物学行为相关。人类SOCS3基因由非编码的第1外显子区,第1内含子区和第2外显子区构成。在本研究中,我们设计并应用甲基化和非甲基化特异性引物分别检测A549细胞中SOCS3基因第1外显子区,第1内含子区和第2外显子区的甲基化状态。我们检测到SOCS3基因第2外显子区甲基化,但非编码的第1外显子区和第1内含子区均未检测到SOCS3基因甲基化,这与以前的文献报道一致。这表明A549细胞中第2外显子区甲基化可能导致SOCS3蛋白表达降低。而去甲基化试剂5-aza-2’-deoxycytidine能够恢复SOCS3在A549细胞中的表达,进一步表明SOCS3表达降低与基因甲基化相关。因此,A549细胞中第2外显子区可能是SOCS3基因甲基化的重要靶点。然而,基因外显子区甲基化的意义有待于进一步研究。研究表明SOCS3基因转染能够抑制A549细胞的增殖。因此,我们进一步探讨SOCS3再表达对于A549细胞迁移的影响。我们发现SOCS3表达恢复能够抑制A549细胞的迁移。研究表明,SOCS3对PDGF诱导的成纤维细胞和HGF促进的与STAT3信号通路相关的角质细胞的迁移都具有负性调节作用。然而,STAT3信号通路可能并未参与SOCS3基因甲基化导致的A549细胞迁移,因为STAT3结合位点并不位于SOCS3基因的第2外显子区内。我们的结果显示与基因甲基化相关的SOCS3表达下调与A549细胞迁移相关,而且去甲基化试剂5-aza-2’-deoxycytidine使SOCS3蛋白再表达后抑制A549细胞的迁移。越来越多的研究显示PYK2对于多种肿瘤的发生发展具有非常重要的作用。在具有转移性和侵袭性的神经胶质瘤和肝癌细胞中PYK2的表达显著增强。侵袭性乳腺癌细胞和小细胞肺癌细胞中均检测到PYK2蛋白Tyr402位点磷酸化,而且与PYK2相关的ERK1/2的活化参与上调人PCa细胞的粘附能力。我们的研究结果也显示,PYK2和ERK1/2的磷酸化水平与A549细胞的迁移能力相关。此外,某些对SOCS3具有调节作用的细胞因子,如SDF-1/CXCL12,也能够活化PYK2。SOCS3可作为PYK2的负性调节因子,抑制T淋巴细胞的迁移能力。我们也注意到SOCS3能够与FAK蛋白磷酸化的Tyr397位点相互作用并抑制FAK激酶活性,而FAK与PYK2高度同源。因此,我们推测SOCS3对PYK2具有调节作用,而且其作用机制很可能与FAK相似。我们发现去甲基化试剂5-aza-2’-deoxycytidine处理使A549细胞中SOCS3表达增加,而PYK2蛋白,Tyr402和ERK1/2磷酸化水平均下降。因此我们认为SOCS3表达上调抑制A549细胞的迁移与PYK2蛋白以及Tyr402和ERK1/2磷酸化水平降低相关。我们进一步研究SOCS3突变体转染对A549细胞迁移,PYK2蛋白表达以及Tyr402和ERK1/2磷酸化水平的影响。外源表达的SOCS3-SH2区缺失突变体,对PYK2蛋白表达以及Tyr402和ERK1/2磷酸化,和A549细胞运动的影响与对照组细胞相似,没有显著差异。这些结果表明A549细胞中SH2区缺失的SOCS3蛋白不具有负性调节PYK2相关功能的作用。SH2区可能为SOCS3调节PYK2所必需。转染KIR区缺失突变体的A549细胞中,PYK2蛋白以及Tyr402和ERK1/2磷酸化水平均低于对照组细胞,转染细胞的迁移也受到抑制。蛋白酶体抑制剂β-lactacystin预处理能够在一定程度上恢复PYK2蛋白以及Tyr402和ERK1/2磷酸化水平,和A549细胞的迁移能力。因此,我们推测SOCS-box介导的依赖于蛋白酶体的PYK2蛋白降解是转染后A549细胞迁移受到抑制的主要机制。免疫共沉淀结果显示,外源表达的SOCS3-SH2或-KIR区缺失突变体和PYK2之间不具有相互作用。此外,SOCS-box缺失突变体转染对PYK2蛋白水平没有影响,但Tyr402和ERK1/2磷酸化水平略低于对照组细胞,而且A549细胞迁移也受到抑制。我们的结果表明SOCS-box缺失突变体可能应用其激酶抑制区下调PYK2激酶活性抑制相关的生物学功能。免疫共沉淀结果证实转染的SOCS-box突变体与PYK2之间具有相互作用。综上所述,外源表达的SOCS3与PYK2相互作用依赖于SOCS3蛋白的SH2和KIR功能区,导致PYK2蛋白水平及其相应的Tyr402 and ERK1/2磷酸化水平降低。外源表达的SOCS3蛋白对PYK2的抑制作用可能主要通过蛋白酶体途径介导的PYK2降解,因为PYK2的mRNA水平在转染前后并没有显著变化。有研究表明,PYK2蛋白磷酸化的Tyr402位点可与Src激酶的SH2区结合进而活化Src,或与CHK的SH2区结合进而抑制乳腺癌细胞迁移。我们的研究结果提示SOCS3能够阻断Tyr402位点磷酸化。然而,SOCS3与PYK2之间的相互作用是否通过磷酸化的Tyr402位点仍有待于进一步研究。此外,SOCS3对PYK2下游与细胞迁移相关的细胞骨架蛋白的调节是否与肺癌转移有关仍需要进一步验证。总而言之,我们的研究结果显示,SOCS3与PYK2相互作用并抑制与PYK2相关的A549细胞的迁移。对SOCS3的深入研究可能为临床阻断肺癌转移提供新的治疗途径。结论1.SOCS3基因异常甲基化导致其在非小细胞肺癌组织中表达下调,可能促进非小细胞肺癌淋巴结转移。2.PYK2过表达可能促进非小细胞肺癌淋巴结转移。3.外源表达的SOCS3对PYK2具有抑制作用,其与PYK2相互作用依赖于SOCS3蛋白的SH2和KIR功能区,SOCS3可能主要通过蛋白酶体途径介导PYK2降解,导致PYK2蛋白水平及其相应的Tyr402 and ERK1/2磷酸化水平降低,最终负性调节细胞迁移。